Практикум 8

Введение

Lactococcus lactis - грамположительная, не спорообразующая и факультативно анаэробная бактерия [1,2]. Широко используется при ферментации пищевых продуктов, особенно сыра, йогурта, квашеной капусты. Помимо молочной кислоты участвует в производстве диацетила, ацетальдегида и ацетата, образующихся в результате смешанной ферментации, и в производстве бактериоцинов [3]. C Lactococcus lactis также проводились исследования по использованию живых, генетически модифицированных бактерий для местной доставки иммуномодулирующих белков при лечении болезни Крона [4].

Фосфоглюкомутазы катализируют взаимопревращение d-глюкозо-1-фосфата и d-глюкозо-6-фосфата, реакцию, центральную для энергетического метаболизма во всех клетках и для синтеза полисахаридов клеточной стенки в бактериальных клетках. Два класса фосфоглюкомутаз (α-PGM и β-PGM) различают на основе их специфичности к α- и β-глюкозо-1-фосфату. Бета-фосфоглюкомутаза относится к суперсемейству галоиддегалогеназ [5]. Также известно что синтез бета-фосфоглюкомутазы в Lactococcus lactis индуцирется мальтозой и подавляется глюкозой [6].

Информация о белке из записи Uniprot

Бета-фосфоглюкомутаза является ферментом и относится к классу изомераз, играет ключевую роль в регуляции потока углеводных промежуточных продуктов при гликолизе и образовании сахарного нуклеотида UDP-глюкозы. По запросу о похожей функции goa:("beta-phosphoglucomutase activity") goa:("carbohydrate metabolic process") taxonomy:"Bacteria[2]" всего было найдено 5435 записей, что говорит о распространенности и важности данного процесса в метаболизме бактерий.

Структура данного белка хорошо изучена, было найдено 52 записи в PDB. Все структуры сделаны с помощью рентгеннографического анализа, минимальное разрешение 1.02 А.

Данные полученные при анализе базы UniRef для данного белка:

  1. В кластере UniRef100 1 запись.
  2. В кластере UniRef90 65 записей, только две из них не относятся к роду Lactococcus.
  3. В кластере UniRef50 648 записей, они относятся к бактериям разных родов.
В каждом кластере последовательность является репрезентативной. По результатам можно сделать вывод, что последовательность данного белка распространена, но не очень широко.

Выбор протеомов

В качестве основного был выбран протеом бактерии, к которой принадлежит белок - Lactococcus lactis subsp. lactis (strain IL1403) (Streptococcus lactis) он является референсным.
Идентификатор:UP000002196
Белков 2225, из них в Swiss-Prot входят 540
CDP: standard, BUSCO: полных генов 97.5%

Так как среди бактерий того же рода не было найдено хорошо изученных протеомов (были референсные, но белков в Swiss-Prot было очень мало или не было совсем) в качестве контроля был выбран референсный протеом бактерии Escherichia coli (strain K12) (Strain: K12 / MG1655 / ATCC 47076)
Идентификатор: UP000000625
Всего белков 4448, из них в Swiss-Prot входят 4400
CPD: Standard, BUSCO: полных генов 99.3%

По количеству белков в Swiss-Prot очевидно, что второй протеом изучен намного лучше.

Для скачивания протеомов использовались следующие команды:

wget 'https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000000625&format=txt&compress=yes' -O UP000000625.swiss.gz
wget 'https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000002196&format=txt&compress=yes' -O UP000002196.swiss.gz

Сравнение протеомов

Так как L.lactis является грамположительной, а E.coli грамотрицательной бактерией, в качестве третьей группы было решено взять белки, участвующие в синтезе тейхоевых кислот, которые характерны только для грамположительных бактерий. Для оценки количества проводился поиск в UniProt, результаты представлены в таблице 1.

1. Трансмембранные белки

Запросы:
annotation:(type:transmem) AND organism:"Lactococcus lactis subsp. lactis (strain IL1403) (Streptococcus lactis) [272623]" AND proteome:up000002196
annotation:(type:transmem) AND organism:"Escherichia coli (strain K12) [83333]" AND proteome:up000000625

2. Ферменты

Запросы:
ec:* AND organism:"Lactococcus lactis subsp. lactis (strain IL1403) (Streptococcus lactis) [272623]" AND proteome:up000002196
ec:* AND organism:"Escherichia coli (strain K12) [83333]" AND proteome:up000000625

3. Белки, участвующие в синтезе тейхоевых кислот

Запросы:
goa:("teichoic acid biosynthetic process [19350]") AND organism:"Lactococcus lactis subsp. lactis (strain IL1403) (Streptococcus lactis) [272623]" AND proteome:up000002196
goa:("teichoic acid biosynthetic process [19350]") AND organism:"Escherichia coli (strain K12) [83333]" AND proteome:up000000625

Таблица 1. Сравнение протеомов по представленности определенных групп белков
Функциональная группа Lactococcus lactis Escherichia coli
Количество Доля Количество Доля
Трансмембранные белки 524 23,55% 957 21,52%
Ферменты 592 26,6% 1694 38,08%
Белки, участвующие
в синтезе тейхоевых кислот		 9 0,04% 0 0%

Доля трансмембранных белков схожа у обеих бактерий, ферментов больше у E.coli, что может быть связано с метаболизмом бактерии или с тем, что протеом лучше аннотирован. Как и ожидалось, белков, участвующих в синтезе тейхоевых кислот у E.coli не обнаружилось.

Определение первой аминокислоты

Для определения первой аминокислоты использовались следующие команды:

zgrep '^SQ' UP000002196.swiss.gz -A1 | grep -v '^SQ' | grep -v '^--' | tr -d ' ' | cut -b 1 | sort | uniq -c
zgrep '^SQ' UP000000625.swiss.gz -A1 | grep -v '^SQ' | grep -v '^--' | tr -d ' ' | cut -b 1 | sort | uniq -c

Результат: 2225 M и 4448 M соответственно. Значит, все белки данных протеомов начинаются с метионина.

Источники

  1. Bolotin A, Wincker P, Mauger S, Jaillon O, Malarme K, Weissenbach J, Ehrlich SD, Sorokin A. The complete genome sequence of the lactic acid bacterium Lactococcus lactis ssp. lactis IL1403. Genome Res. 2001;11:731–53.
  2. Parapouli M, Delbes-Paus C, Kakouri A, Koukkou AI, Montel MC, Samelis J. Characterization of a wild, novel nisin a-producing Lactococcus strain with an L. lactis subsp. cremoris genotype and an L. lactis subsp. lactis phenotype, isolated from Greek raw milk. Appl Environ Microbiol. 2013;79:3476–84.
  3. A review on Lactococcus lactis: from food to factory Song, A.AL., In, L.L.A., Lim, S.H.E. et al. A review on Lactococcus lactis: from food to factory. Microb Cell Fact 16, 55 (2017).
  4. Braat H, Rottiers P, Hommes DW, Huyghebaert N, Remaut E, Remon JP, van Deventer SJ, Neirynck S, Peppelenbosch MP, Steidler L. A phase I trial with transgenic bacteria expressing interleukin-10 in Crohn's disease. Clin Gastroenterol Hepatol. 2006 Jun;4(6):754-9.
  5. Caught in the Act:  The Structure of Phosphorylated β-Phosphoglucomutase from Lactococcus lactis Sushmita D. Lahiri, Guofeng Zhang, Debra Dunaway-Mariano, and Karen N. Allen Biochemistry 2002, 41, 26, 8351–8359 Publication Date:June 5, 2002.
  6. Purification and characterization of two phosphoglucomutases from Lactococcus lactis subsp. lactis and their regulation in maltose- and glucose-utilizing cells Authors: N Qian, G A Stanley, B Hahn-Hägerdal, P Rådström.