Занятие 4:анализ модели белка

Критический анализ модели левансахаразы Gluconacetobacter diazotrophicus в сопотавлении с гомологом из Bacillus subtilis (PDB-код: 1W18)

Источник:

C.Martinez-Fleites et al, 2005:Crystal structure of levansucrase from the Gram-negative bacterium Gluconacetobacter diazotrophicus.

В отчете приведены результаты анализа качества структуры левансахаразы, расшифрованной методом РСА в 2005 году К.Мартинесом-Флейтесом и др., и содержащимся в PDB под кодом 1w18.
Выявлено, что гидролитическая машинерия левансахараз высоко консервативна, и что сайты связывания ионов кальция в белке Bacillis Subtilis и дисульфидный мостик Cys339-Cys395 занимают эквивалентные позиции в структуре, т.е., возможно, играют сходную роль в ее стабилизации.

Основные свойства белка

Левансахараза - фермент (LsdA, EC 2.4.1.10), превращающий фруктозу в фруктозоолигосахариды:

--------------->

Фермент относится к семейству 68 гликозидгидролаз.

Получение структуры

Структура была определена с помощью рентгеноструктурного анализа на разрешении 2.5 A и усовершенствована методом молекулярного замещения с использованием гомолога из Bacillus subtilis (PDB-код: 1OYG).
R-факторы составили: 19.6%(R-cryst) и 24.9% (R-free). Для подсчета последнего использовано 5% рефлексов.
Асимметрическая единица содержит две копии цепи, а также в модель вошли 194 молекулы воды и четыре сульфат-иона.
Вот как выглядит эта структура:

C.Martinez-Fleites et al, 2005
На двух нижних изображениях показана структура каталитического центра.

Основная информация о модели (данные EDS)

Минимальное разрешение 0.250 А
Максимальное - 52,19 А
R-free из заголовка PDB: 0.200
R-фактор: 0.215 (что достаточно близко к R-free, т.е. уже черновая модель была достаточно удачной)
Полноценность данных: 99.0 %
Группа симметрии: P 21 21 21
Параметры ячейки: a=53.80 A, b=119.39 A, c=215.10 A alpha=90.00, beta=90.00, gamma=90.00
Число рефлексов: 48513 (49013 в CIF файле). Процент использованных - 99%.
Коэффициент корреляции Fo и Fc : 0.926
Стандартное отклонение для RSR - пространственного R-фактора: 0.147
Стандартное отклонение для коэффициента корреляции для электронной плотности: 0.957

Были обнаружены некоторые маргинальные остатки:
Для цепи А (Asn503):

И В - Ala214, Gln232, Ser379, Asp479:

Например, остаток Ala214 имеет RSR 0,28. Вот его электронная плотность (голубым) в сопоставлении со всей молекулой (зеленым):

И отдельно:

Анализ PROCHECK

На карте Рамачандрана в этой выдаче нет остатков, которые находились бы в запрещенной области. 83% в наиболее благоприятной области, 16,1% - в разрешенной и 0,9% - в допустимой. Это не очень хорошие показатели, так как при разрешении от 2 А качественной считается модель, где в предпочтительной области - 90% остатков.

WHAT_CHECK

На картах Рамачандрана: х - глицины, квадратами - пролины, + - остальные остатки.
Для цепи А:
И В:

Обнаружены нарушения в конформациях некоторых остатков аргинина, тирозина, фенилаланина, аспарагиновой и глутаминовой кислот; ненормальные длины связей и значения углов; ненормальные конформации остова. Имеются остатки с неправильным окружением:

  30 ASP   (  92-)  A
  61 ASP   ( 123-)  A
  79 ASP   ( 141-)  A
 109 ARG   ( 171-)  A
 121 ARG   ( 183-)  A
 128 ARG   ( 190-)  A
 144 ASP   ( 206-)  A
 182 ASP   ( 244-)  A
 188 ASP   ( 250-)  A
 211 ASP   ( 273-)  A
 230 ASP   ( 292-)  A
 241 GLU   ( 303-)  A
 247 ASP   ( 309-)  A
 265 GLU   ( 327-)  A
 272 ARG   ( 334-)  A
 292 GLU   ( 354-)  A
 296 GLU   ( 358-)  A
 336 ASP   ( 398-)  A
 339 GLU   ( 401-)  A
 358 ARG   ( 420-)  A
 366 ASP   ( 428-)  A
 380 ARG   ( 442-)  A
 399 ASP   ( 461-)  A
 465 ARG   ( 527-)  A
 481 ARG   ( 543-)  A

HIS, ASN, GLN в неправильной ориентации:

47 ASN   ( 109-)  A
 132 ASN   ( 194-)  A
 158 ASN   ( 220-)  A
 193 ASN   ( 255-)  A
 203 GLN   ( 265-)  A
 235 GLN   ( 297-)  A
 239 GLN   ( 301-)  A
 244 ASN   ( 306-)  A
 260 ASN   ( 322-)  A
 267 ASN   ( 329-)  A
 287 ASN   ( 349-)  A
 295 GLN   ( 357-)  A
 305 GLN   ( 367-)  A
 357 HIS   ( 419-)  A
 387 ASN   ( 449-)  A
 401 ASN   ( 463-)  A
 420 GLN   ( 482-)  A
 491 GLN   ( 553-)  A
 506 GLN   (  75-)  B
 539 GLN   ( 108-)  B
 540 ASN   ( 109-)  B
 545 GLN   ( 114-)  B
 625 ASN   ( 194-)  B
 686 ASN   ( 255-)  B
 696 GLN   ( 265-)  B
 728 GLN   ( 297-)  B
 732 GLN   ( 301-)  B
 737 ASN   ( 306-)  B
 753 ASN   ( 322-)  B
 760 ASN   ( 329-)  B
 880 ASN   ( 449-)  B
 894 ASN   ( 463-)  B
 913 GLN   ( 482-)  B
 917 HIS   ( 486-)  B
 978 ASN   ( 547-)  B

Итак, авторы получили более или менее точную модель левансахаразы, однако некоторых недостатков все же не удалось избежать; R-free все же немногим больше 20%, и в предпочтительной области на карте Рамачандрана находятся менее 90% остатков. Некоторые остатки плохо вписались в электронную плотность, не у всех комфортное окружение и правильная ориентация.
Настораживает и то, что с последовательностью гомолога из Bacillus subtilis всего 31% сходства.