Изображение области связывания нуклеотида тимина с DPO3E_ECOLI

Здесь изображена область связывания лиганда. Тонкими линиями(wireframe) показана часть белка, котороя не участвует в связывании с лигандом, жирными - непосредственно участвующая в связывании и молекулы тимин нуклеотида.Большими шариками показаны атомы, кторые непосредственно связывающие (фиолетовым цветом обозначены атомы Mn ²⁺, крсными - кислорода,синим - азота), малыми шарикаим - атомы участвующие в образовании водородных связей.

Эта область была выделена с помощью данных PDB файла и программы RasMol (выделялась 5 Å окрестность лиганда)

Генно-инженерный проект

а). Аминокислотные остатки моего белка, которые контактируют с ионами Mn2+:
Glu14 Asp12 Asp167 Это те аминокислоты, при замене которых способность связывания может сильно измениться (первые кандидаты для мутагенеза). У всех эти аминокислот радикалы являются кислотами, на конце у них расположены депротонированые карбоксильные группы.

б). Предполагаемая замена аминокислотного остатка белка, которая может привести к потере способности связывания:
При изменении аминокислот из пункта а), вероятность потери cвязывания наиболее велика. Все приведенные аминокислотные остатки обладают кислотными свойствами, они гидрофильны и их концевые атомы кислороды, которые тянут на себя электронную плотность с атомов Mn превращая в Mn2+ , марганец в свою очередь соединяется с нуклеотидом TMP, то есть ион марганца является связывающим. Чтобы белок перестал связываться с TMP и Mn достаточно, чтобы аминокислотные остатки перестали связываться с Mn, поэтому можно заменить либо на остатки, не содержащих на конце сильно электроотрицательных атомов (таких аминокислотных остатков очень много). Можно сказать, что при замене этих аминокислот на какие-либо другие способность связывания сильно изменитя и данный комплекс развалиться. То есть в нашем генно-инжененрном эксперименте достаточно поменять Glu14,Asp12,Asp167 на аминокислоты: аргинин, лизин, гистидин (как аминокислоты, которые наоборот в водном растворепротонируются и будут отталкивать атомы марганца), аланин, глицин, лейцин, изолейцин,фенилаланин, валин(как гидрофобные и неимеющие коцевых заряженных атомов). Остальные аминокислоты также будут плохо связывать металл (кроме аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты в различных вариациях расположения данных аминокислот с данными номерами), но в отличие от гидрофобных и щелочных остатков, они могут частично их связывать, хотя и вероятность этого не велика. Поменять способность связывания с нуклеотидом мы непосредственно не можем, так как не можем поменять его состав, TMP крепится к белку через Mn2+, поэтому способность связывания с ним мы меняем путем изменения связывания с белком. Однако существуют две водородные связи, которые хотя и не очень сильно связывают нуклеотид, но все-таки оказывают значительное влияние на связывание, то есть если мы хотим повлиять на связывание, то нам достаточно взять аминокислоты, несодержащие атомов кислорода и азота и не будет водородных связей(заменить His66 и Glu61 на гидрофобные аминокислоты: аланин, глицин, лейцин, изолейцин,фенилаланин, валин), таким образом проверим влияние водородных связей на связывание. Таким образом существует путь блокирования работы данной субъединицы белка (мы помним, что нам дана лишь одна субъединица), который несет важную роль в жизни клетки. Как мы видим.что замена практически на любую другую аминокислоту приводит к очевидному нарушению работы, поэтому последовательность, кодирующая данный элемент цепи ДНК должна быть очень консервативна. Что касается второй молекулы TMP 2100, то она собственно неи связывается с ионами марганца, поэтому смена связывающих ее аминокислот не повлияет на связывание с Mn. Однако скажем о том, что если эта молекула будет использоваться в дальнейшем, и вданный момент она лишь "ждет", то при замене аминокислот,которые образуют с ней водородные связи, может произойти такое, что белок также не будет работать, так как не будут поступать новые нуклеотиды, так как не будет механизма связывающих их. Это аминокислоты Asn99 и Leu145. Достаточно провести замену, на аминокислоты, не содержащие атомов азота и кислорода, чтобы исключить возможность связывания водородными связями (аланин, глицин, лейцин, изолейцин,фенилаланин, валин) ипроверить предположении о дальнейшем использовании нуклеотида.
в). Предполагаемая замена аминокислотного остатка белка, контактирующая с ионами Mn, но тем не менее, предположительно, мало влияющая на способность связывания с лигандом.
Как показано в пункте б) данные нуклеотиды очень консервативны и замена их на другие повлечет за собой необратимую потерю связывания. Мы можем поенять их на экивалентные, то есть аспарагиновую кислоту на глутаминовую, и наоборот. Так же, на мой взгляд, мы можем изменить одну из аминокислот, чтобы связывание изменилось не сильно (может быть именно по-этому Mn2+ крепится тремя аминокислотами, четырьмя кислородами). Делая такое предположене мы можем изменить, допустим, Glu14 или Asp12 или Asp167, на любую аминокислоту (не содержащую в остатке NH и NH2 групп, так как они не только не помогают, но и мешают связыванию), таким образом марганец будет связываться не 4-мя, а 3-мя атомами кислорода (так как ориентироваться они будут все равно на максимальное соединение). Что касается водородных связей, то при замене на аминокислоты,которые содержат в составе атомы азота и кислорода, существует большая вероятность образования их. На мой взгляд наилучшими при замене являются аргинин, лизин, глутамин в замене на гистидин или аспарагин; аспарагиновая кислота в замен глутаминовой. Таким образом, способность связывания сильно не поменяется.