Цель задания: Выбрать сборку генома эукариотического организма, подходящую по некоторым параметрам качества, охарактеризовать ее по предложенному плану и скачать файлы, которые потребуются для работы на следующем занятии. Познакомиться с системами поиска на сайтах NCBI и ENA.
В качестве эукариотического организма для анализа сборки генома я выбрала Saccharomyces cerevisiae(baker's yeast/пекарские дрожжи).
Это одноклеточный гриб диаметром около 5-10 микрометров. Является одним из фундаментальных модельных организмов в биологии, биохимии, генетике и биотехнологии. Это первый эукариот, чей геном был полностью секвенирован(1996 г.)
S. cerevisiae сыграли ключевую роль в развитии таких областей, как изучение клеточного цикла, регуляции транскрипции, механизмов рекомбинации ДНК, а также в исследованиях старения и апоптоза у эукариот.Благодаря простоте культивирования и генетическим манипуляциям, дрожжи часто используют в молекулярной биологии и в качестве продуцентов в промышленном синтезе инсулина, вакцин и других биопрепаратов.
Saccharomyces cerevisiae (пекарские дрожжи) размножаются почкованием. Сначала на материнской клетке появляется вырост, затем происходит деление ядра и формирование новой клеточной стенки. После этого дочерняя клетка отделяется. На месте почкования остается шрам, по которому можно определить возраст клетки. Одна материнская клетка может образовать 20-30 дочерних клеток.
Дрожжи могут существовать в двух состояниях: гаплоидном (один набор хромосом) и диплоидном (два набора хромосом). В природе преобладает диплоидная фаза. При неблагоприятных условиях диплоидные клетки образуют гаплоидные споры путем мейоза. При слиянии гаплоидных клеток снова образуются диплоидные.
Геном дрожжей S. cerevisiae состоит примерно из 12 156 677 пар оснований и 6275 генов, компактно организованных на 16 хромосомах. Считается, что только около 5800 из этих генов являются функциональными.
Мой поисковый запрос на сайте NCBI Datasets был следующим: Saccharomyces cerevisiae + фильтры: уровень сборки Chromosome и выше, а также был включен фильтр Annotated genomes).
По данному поисковому запросу была найдено 125 сборкок, из них только R64 полностью подходила по всем параметрам.
| Параметр | Значение |
|---|---|
| Идентификатор GenBank | GCA_000146045.2 |
| Идентификатор RefSeq | GCA_000146045.2 |
| Уровень сборки генома | Complete Genome * |
| Общий размер генома (п.н.) | 12071326 |
| Число хромосом | 16 |
| Число фрагментов генома в сборке (Number of scaffolds) | 16 |
| Scaffold N50 | 924431 |
| Scaffold L50 | 6 |
| Число контигов | 16 |
| Contig N50 | 924431 |
| Contig L50 | 6 |
* Complete Genome - в нее включены все ожидаемые хромосомы, причем каждая из них не имеет пропусков, нелокализованных скэффолдов и последовательностей длины 10 и более неоднозначных оснований, помимо этого, если есть геном органелл, то он также не содержит пробелов (согласно документации NCBI FTP README_assembly_summary.txt Column 12).
Number of scaffolds = общее количество таких фрагментов в сборке
Scaffold (скаффолд) — это непрерывный фрагмент сборки, который может содержать пробелы (gaps)
Scaffold N50 — это длина самого короткого скаффолда в наборе самых длинных скаффолдов, которые в сумме покрывают 50% генома.Для сборок уровня "Chromosome" Scaffold N50 обычно очень высокий, так как хромосомы собраны полностью.
Scaffold L50 — это минимальное количество самых длинных скаффолдов, которые в сумме покрывают 50% от общего размера генома.
Number of contigs (число контигов) — это общее количество непрерывных участков ДНК в сборке, между которыми нет пробелов (gaps).
Contig (контиг) — непрерывный фрагмент ДНК, собранный из прочтений секвенатора без разрывов. Scaffold (скаффолд) может состоять из нескольких контигов, соединенных пробелами (N)
Contig N50 — это длина самого короткого контига в наборе самых длинных контигов, которые в сумме покрывают 50% генома.
Contig L50 — это количество самых длинных контигов, сумма длин которых составляет половину от общего размера генома.
В чем разница между Scaffold N50 и Contig N50:
Сборка практически идеально отражает биологическую реальность. Во-первых, число скаффолдов равно числу хромосом (16), то есть геном собран полностью. Во-вторых, Scaffold N50 равен Contig N50 (924,431 п.н.), а Scaffold L50 равен Contig L50 (6). Это прямое доказательство того, что в сборке нет пробелов. 50% генома покрывается всего 6-ю самыми длинными хромосомами, и они же являются и самыми длинными непрерывными контигами. Это говорит о высочайшей точности и полноте сборки.
Основные три файла (скачаны из базы данных RefSeq), содержащие главную информацию о геноме выбранного органзима:
Основная часть файлов была скачена на локаьный компьютер
Рисунок 1. Распределение длин контигов в сборке S. cerevisiae R64
На графике представлены длины 16 контигов (хромосом) дрожжей, отсортированные по убыванию. Красными пунктирными линиями отмечена точка, соответствующая метрикам N50 и L50.
График демонстрирует плавное экспоненциальное убывание длин контигов, что характерно для качественных сборок уровня "Chromosome". Отсутствие резких скачков свидетельствует о равномерном распределении генетического материала по хромосомам.
Количество контигов (16) точно соответствует известному числу хромосом S. cerevisiae, что подтверждает полноту сборки генома.
Метрика L50 = 6 указывает, что всего 6 самых длинных хромосом покрывают 50% всего генома. Это отражает биологически обоснованное распределение генетической информации, где наиболее важные гены сосредоточены в крупных хромосомах.
Точка пересечения красных линий на графике четко показывает, что контиг №6 длиной 924,431 п.н. является тем порогом, выше которого находятся последовательности, покрывающие половину генома.
Использование логарифмических шкал по обеим осям эффективно визуализирует широкий диапазон длин хромосом (от ~270 тыс. до ~1.5 млн п.н.) на одном графике.
Полученный график и рассчитанные метрики подтверждают, что сборка R64 представляет собой высококачественную референсную сборку, полностью отражающую биологическую структуру генома Saccharomyces cerevisiae. Отличные показатели N50 и L50 в сочетании с идеальным соответствием числа контигов числу хромосом делают данную сборку надежным фундаментом для последующих биоинформатических исследований.
European Nucleotide Archive (ENA) — это крупнейшая европейская база данных нуклеотидных последовательностей, управляемая Европейским институтом биоинформатики (EBI). ENA является одной из трех основных международных баз данных вместе с NCBI (США) и DDBJ (Япония).
Поиск мРНК актина человека: tax_eq(9606) AND (description="actin" OR product="actin") AND moltype="mRNA" Поиск генов актина: tax_eq(9606) AND gene="actin" Универсальный запрос: tax_name="Homo sapiens" AND (gene="actin" OR product="actin")
ENA является частью глобальной сети баз данных и ежедневно обменивается данными с NCBI и DDBJ, обеспечивая согласованность информации во всех трех основных хранилищах.
ENA представляет собой современную и эффективную платформу для работы с нуклеотидными последовательностями, особенно сильную в области доступа к raw-данным секвенирования и европейским исследовательским проектам. Хотя ENA может потребовать некоторого времени для освоения, она предлагает мощные возможности поиска и является ценным дополнением к инструментарию биоинформатика.
Национальный центр биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information, NCBI) — это ведущая американская организация, созданная в 1988 году как подразделение Национальной медицинской библиотеки США. Это главный мировой ресурс для получения биомедицинской и генетической информации.
Поиск генов актина человека: "actin"[Gene Name] AND "Homo sapiens"[Organism] Поиск полных мРНК: "actin"[mRNA] AND "complete cds"[Filter]
NCBI тесно связан с другими международными базами данных (ENA в Европе и DDBJ в Японии), что обеспечивает согласованность информации по всему миру.
NCBI остается основным инструментом для большинства исследований в области молекулярной биологии благодаря своей надежности, полноте данных и мощным аналитическим возможностям.
DNA Data Bank of Japan (DDBJ) — это японский центр нуклеотидных последовательностей, основанный в 1986 году. DDBJ является одним из трех международных партнеров в системе обмена данными вместе с NCBI (США) и ENA (Европа). Центр расположен в Национальном институте генетики в Мисиме, Япония.
Поиск генов актина человека: organism:"Homo sapiens" AND gene:actin Поиск мРНК актина: organism:"Homo sapiens" AND product:actin AND molecule:"messenger RNA" Поиск с несколькими условиями: (organism:"Homo sapiens" OR organism:"Mus musculus") AND gene:actin
DDBJ активно участвует в International Nucleotide Sequence Database Collaboration (INSDC) — международном сотрудничестве с NCBI и ENA. Это обеспечивает ежедневный обмен данными и поддержание согласованности информации во всех трех базах данных.
DDBJ особенно силен в области данных, связанных с азиатской флорой и фауной, включая уникальные виды риса, шелкопряда, а также различные морские организмы, характерные для азиатского региона. Центр также специализируется на данных японских исследовательских проектов и национальных геномных инициативах.
DDBJ является важным компонентом глобальной системы биоинформатических ресурсов, предлагая уникальный доступ к азиатским геномным данным. Хотя интерфейс может быть менее современным, чем у ENA, DDBJ предоставляет ценную информацию, особенно для исследований, связанных с азиатскими организмами и специализированными проектами. Для полного охвата данных рекомендуется использовать все три основные базы данных в комбинации.
Соотношение является идеальным. У дрожжей 16 хромосом. В сборке R64 мы видим 16 скаффолдов и 16 контигов. Это означает, что каждая биологическая хромосома собрана в один непрерывный фрагмент ДНК без пробелов. Совпадение числа скаффолдов и контигов (16=16) подтверждает, что в сборке отсутствуют пропуски (gaps), что и характеризует уровень 'Complete Genome'
Представьте, что геном — это длинная книга, которую разрезали на множество фрагментов. Нам нужно понять, насколько хорошо она восстановлена. Для этого используют две ключевые метрики: N50 и L50.
N50 показывает длину характерного фрагмента сборки. Если мы возьмем все фрагменты, отсортируем их от самого длинного к самому короткому и начнем последовательно складывать их длины, то N50 — это длина того фрагмента, при добавлении которого суммарная длина впервые достигнет половины от общего размера генома.
L50 показывает, сколько фрагментов понадобилось для достижения этой половины. Это минимальное количество самых длинных фрагментов, которые в сумме покрывают 50% генома.