Секвенирование по Сэнгеру

1.Получение последовательности ДНК на основании данных, полученных из капиллярного секвенатора

исходный файл с прямой последовательностью

исходный файл с обратной последовательностью

Файл с консенсусной последовательностью

Файл с выравниванием последовательностей

Работа с хроматограммами проводилась в программе Chromas, т.к. GeneStudio (по непонятным мне причинам) считал один из исходных файлов пустым, а также на некоторых участках хроматограммы не отображал последовательность.
В Chromas обратная последовательность была "перевёрнута и сделана комплементарной", потом были скачаны прямая и 'перевёрнутая' обратная последовательности в fasta и выравнены с помощью needle (выравнивание исходных последовательностей), чтобы было понятно, какие участки ДНК можно проверять с помощью второй последовательности.
Удаление нечитаемых 5' и 3'-концов:Б
В прямой последовательности: 5'-конец - я бы удалила первые 17 нуклеотидов (Chromas убрал 21), 3'-конец - на мой взгляд всё чётко видно (программа убрала 3 последних нукдеотида)
В обратной последовательности (уже развернутой и комплементарной): 5'-конец - я бы ничего не удаляла (Chromas согласен), 3'-конец - на мой взгляд нужно удалить 36 нуклеотидов (программа убрала 88)
В целом хроматограммs довольно хорошо чита.тся, уровень шума низкий (на глаз), редактировались в основном полиморфизмы.

Проблемные нуклеотиды

1)На рис.1 изображён участок обратной цепи, выделенный нуклеотид я посчитала проблемным, поскольку не очень понятно к чему относится смещённый пик, это полиморфизм или ошибка фореза. На рис.2 изображён тот же участок но уже прямой цепи, и здесь пик не смещён, т.е. это был полиморфизм(Y). (решение Chromas по данному нуклеотиду - N)

обратная цепь

Рис.1 обратная цепь

прямая цепь

Рис.2 прямая цепь

2)На рис.3 изображён участок обратной цепи, ситуация аналогична предыдущей. На рис.4 - тот же участок но уже прямой цепи, пик не смещён, т.е. это был полиморфизм(K). (программа приняла такое же решение)

обратная цепь

Рис.3 обратная цепь

прямая цепь

Рис.4 прямая цепь

3)4)На рис.5 - участок прямой цепи, здесь сразу два непонятных места. Во-первых, расстояние между пиками G и A больше среднего, возможно там должен стоять нуклеотид. Но нет, см рис.6: пики чёткие и расстояние нормальное. Во-вторых, пики аденинов (рис.5) частично слиты, что наводит на мысль об ошибке. Но опять же смотрим обратную цепь (рис.6) с 4 чёткими пиками аденинов, значит эта неточность фореза не привела к ошибке.

обратная цепь

Рис.5 прямая цепь

прямая цепь

Рис.6 обратная цепь

5)На рис.7 - участок прямой цепи, где мы опять видим несколько слившихся пиков, и возможно в ДНК больше нуклеотидов, чем выдала программа. Смотрим на обратную цепь (рис.8), действительно, один аденин был пропущен.
Неточности на данном участке прямой цепи, не очень удивительны, т.к. он расположен довольно близко к 5'-концу.

обратная цепь

Рис.7 прямая цепь

прямая цепь

Рис.8 обратная цепь

2.Нечитаемый фрагмент хроматограммы

нечитаемая хроматограмма

Рис.9 фрагмент хроматограммы

Я выбрала хроматограмму из паки bad/NN_G10.ab1. На рис.9 представлен её участок, Chromas не справился с его прочтением, я тоже, т.к. пики накладываются друг на друга, и совершенно непонятно, какую букву им присвоить. Возможно, наложение пиков происходит, потому что в образце было 2 разные ДНК.