Сборка de novo

Команды использованные в данном практикуме:

wget ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR424/000/SRR4240360/SRR4240360.fastq.gz

cat /mnt/scratch/NGS/adapters/* 1> adapters.fasta

java -jar /usr/share/java/trimmomatic.jar SE -phred33 -threads 15 \
SRR4240360.fastq.gz SRR4240360_no_adapters.fastq.gz \
ILLUMINACLIP:adapters.fasta:2:7:7 2>>logs/trimmomatic.log

java -jar /usr/share/java/trimmomatic.jar SE -phred33 -threads 15 \
SRR4240360_no_adapters.fastq.gz SRR4240360_good.fastq.gz \
TRAILING:20 MINLEN:32 2>>logs/trimmomatic.log

velveth ./SRR4240360_velvet 31 -fastq.gz -short SRR4240360_good.fastq.gz \
&>>logs/velvet.log

velvetg ./SRR4240360_velvet &>>logs/velvet.log

В рамках данного практикума производилась сборка de novo генома бактерии Buchnera aphidicola из чтений с кодом доступа SRR4240360, полученных из базы EMBL (первая команда). Данные чтения содержат в себе последовательности адаптеров, поэтому предварительно был получен файл, содержащий все возможные адаптеры, используемые прибором Illumina (вторая команда). После удаления адаптеров из чтений (третья команда) количество чтений сократилось с 8 254 632 до 8 212 774, при этом 41 858 (0.51%) оказались остатками адаптеров. Далее было призведено удаление чтений по качеству (четвёртая команда), в результате чего было удалено 297 300 чтений. Размеры файлов чтений до и после очистки:

SRR4240360.fastq.gz 194M
SRR4240360_no_adapters.fastq.gz 193M
SRR4240360_good.fastq.gz 184M

Далее из оставленных чтений были получены k-меры, длиной 31 bp (пятая команда). Эти k-меры были использованы для сборки контигов (шестая команда).

Для полученной сборки N50 составил 43 100 bp. Самые длинные контиги имеют следующие характеристики:

Таблица 1. Самые длинные контиги.

Имя контига	Длина (bp)	Покрытие
NODE_1_length_113474_cov_33.525459	113 574	33,53
NODE_5_length_83603_cov_33.646065	83 633	33,65
NODE_4_length_64155_cov_35.847324	64 185	35,85

Контиги с очень маленьким и очень большим покрытием имеют длину менее 61 bp, поэтому они не включены в файл configs.fa. Среди контигов, которые есть в файле contigs.fa наибольшее покрытие у контига NODE_40_length_69_cov_109.391304, наименьшее – у контига NODE_565_length_31_cov_1.612903.

Далее самые длинные контиги из Таблицы 1 были выравнены с референсным геномом Buchnera aphidicola (GenBank/EMBL AC — CP009253). Для этого был использован алгоритм megablast с длиной слова 28. Также для получения дополнительной карты локального сходства был запущен алгоритм blastn с длиной слова 11.

С исполбзованием того же самого файла с чтениями была получена сборка программой velvet с длиной k-мера 27 bp. Также были получены три сборки программой SPAdes с длинами k-меров 27 bp и 31 bp. Также программа SPAdes была запущена без указания длины k-меров. По умолчанию, последовательно используется несколько длин k-меров, после чего формируется окончательная сборка. Параметр --only-assembler позволяет проводить сборку без предварительной коррекции.

velveth ./SRR4240360_velvet_27 27 -fastq.gz -short SRR4240360_good.fastq.gz \
&>>logs/velvet_27.log

velvetg ./SRR4240360_velvet_27 &>>logs/velvet_27.log

spades.py -s SRR4240360_good.fastq.gz -k 27 --only-assembler -o SRR4240360_SPAdes \
2>> ./logs/SPAdes.log

spades.py -s SRR4240360_good.fastq.gz -k 31 --only-assembler -o SRR4240360_SPAdes \
2>> ./logs/SPAdes.log

spades.py -s SRR4240360_good.fastq.gz --only-assembler -o SRR4240360_SPAdes \
2>> ./logs/SPAdes.log

Далее полученные сборки были сравнены по таким параметрам, как количество контигов, N50, длина самого длинного контига и его покрытие. Сравнение показывает, что при уменьшении длины k-мера до 27 качество сборки, полученной программой velvet заметно падает. При этом сборка, полученная программой SPAdes не настолько сильно зависит от длины k-мера и по качеству превосходит сборку, полученную velvet. Также хочу отметить, что программа SPAdes выдаёт все длины в bp, в отличие от velvet, где длины привидены в количестве k-меров и для получения корректных значений длин к ним нужно прибавлять k-1.

Таблица 5. Сравнение различных сборок.

Сборка	Количес­тво контигов	N50	Самый длин­ный контиг (bp)	Покрытие самого длин­ного контига (%)
velvet k=31	565	43 100	113 504	33,53
velvet k=27	3 262	15 848	83 755	50,01
SPAdes	502	83 739	174 223	17,20
SPAdes k=31	108	83 633	113 504	27,69
SPAdes k=27	258	341 021	341 021	51,92