---

Сборка de novo

---

Получение чтений

wget ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR424/008/SRR4240358/SRR4240358.fastq.gz

AC: SRR4240358

Организм: Buchnera aphidicola str. Tuc7 (Acyrthosiphon pisum)

Прибор: Illumina Genome Analyzer II

Тип: одноконцевые (SE)

Подготовка чтений программой trimmomatic

Удаление адаптеров

Я создала поддиректорию pr15, в которой находятся все данные для этого практикума. Скопировала в неё файлы из /mnt/scratch/NGS/adapters и объединила их с помощью команды

cat * > adapters.fa

Далее вырезала адаптеры:

TrimmomaticSE -threads 10 SRR4240358.fastq.gz SRR4240358_without_adapters.fastq.gz ILLUMINACLIP:adapters.fa:2:7:7 2> log.txt

В файл log.txt была записана информация о работе программы. Из него узнала, что 1,66% последовательностей оказались адаптерами и были удалены.

Удаление нуклеотидов с низким качеством

 TrimmomaticSE -threads 10 -phred33 SRR4240358_without_adapters.fastq.gz trimm_SRR4240358.fastq.gz TRAILING:20 MINLEN:32 2> trimm_log.txt

TRAILING:20 устанавливает, что будут удаляться нуклеотиды с качеством меньше 20. MINLEN:32 удаляет чтения длиной меньше 32 нуклеотидов.

В файле с логами можно увидеть, что было удалено 2352447 (22.69%) чтений.

Размеры файлов:

Изначальный файл с чениями – 493М

Без адаптеров – 485М

После триммирования – 357М

Получение k-меров

velveth velveth_out/ 31 -fastq.gz -short trimm_SRR4240358.fastq.gz

velveth_out/ – директория, куда будут помещены файлы с результатом работы программы;

31 – длина k-меров;

-fastq.gz – опция, задающая формат файла с чтениями;

-short – короткие непарные чтения

trimm_SRR4240358.fastq.gz – файл с чтениями, подающийся на вход программе

Сборка k-меров

velvetg velveth_out/

velveth_out/ – папка с файлами, полученными в результате работы velveth.

Из вывода в stdout прочитала, что N50 = 8600; максимальная длина контига – 19821.

В файле stats.txt находятся данные о контигах в виде таблицы с разделением табуляцией. Длина находится во втором столбце. Длины трёх самых длинных контигов нашла с помощью команды

cut -f2 stats.txt | sort -n | tail -n 3

Далее открыла stats.txt и с помощью поиска по файлу нашла ID и покрытия для этих трёх самых длинных контигов:

Чтобы найти контиги с аномальными покрытиями, отсортировала стобец с покрытиями с помощью команды

cut -f6 stats.txt | sort -n > cov.txt

Есть контиги с аномально большими и аномально маленькими покрытмиями. Вот некоторые из них:

Видно, что длины всех контигов с аномальными покрытиями меньше 31 (длина k-меров). Такие контиги не попадают в contig.fa. Контиг, у которого покрытие выбивается больше всего (111576.000000) имеет длину 1 нуклеотид, поэтому неудивительно, что у него такое большое покрытие

Анализ

Я разбила файл на отдельные контиги с помощью seqretsplit и затем осуществила megablast с контигами с наибольшей длиной и хромосомой Buchnera aphidicola.

Самый длинный контиг

Было найдено три гомологичных участка:

Видно, что между вторым и третьим участком находится большой негомологичный участок

Второй по длине контиг

Было найдено 6 гомологичных участков:

На DotPlot видно, что между гомологичными участками происходили делеции. Между первым и вторым находится большой негомологичный участок.

Третий по длине контиг

Было найдено 2 гомологичных участка:

На DotPlot наклон отрицательный, значит контиг был перевёрнут