BLAST

Для выполнения практикума была взята аминокислотная последовательность дУТФазы, выделенной из Amycolatopsis orientalis HCCB10007 (YP_008011580.1).
Задача: найти гомологов данного белка в базах данных последовательностей.

1. Поиск сходных последовательностей в базе данных Refseq_protein.

Для поиска гомологичных последовательностей на сайте NCBI был запущен BLASTP по базе данных refseq_protein. В дополнительных параметрах я установила максимальное количество находок 20000, чтобы увидеть все найденные гомологи. Все остальные параметры были оставлены по умолчанию. В результате было получено 8708 находок. Из них 7655 прокариотических белков, 813 эукариотических, 35 - архейных и 205 вирусных белка. Параметры для лучшей и худшей находок и для находки из середины списка указаны в таблице 1.

Таблица 1. Сравнение гомологов для исследуемого белка, найденных BLASTP по базе данных Refseq_protein.

Название белка	Организм	Длина выравнивания	bit score	% идентичных колонок	% сходных колонок	E-value	Выравнивание
deoxyuridine 5'-triphosphate nucleotidohydrolase	Amycolatopsis alba	159	304	99	99	1e-102	Выравнивание
deoxyuridine 5'-triphosphate nucleotidohydrolase	Bartonella bacilliformis	149	103	43	56	4e-24	Выравнивание
deoxycytidine triphosphate deaminase	Corynebacterium sputi	62	36.2	39	53	9.5	Выравнивание

Исходя из условного критерия, что находка является гомологом всей последовательности, если E-value < 1e-3 и не менее 70% запроса вошло в полученное выравнивание (Query cover), из полученных находок можно считать гомологами исходной последовательности более 5000 (к сожалению, находок слишком много и BLAST просто подвисает при попытке отфильтровать результаты с помощью Formatting options). С графическим представлением результатов поиска, содержащим 1000 находок, которые достоверно можно считать гомологами можно ознакомиться на рисунке 1.

Рисунок 1. Графическое представление результатов поиска, содержащее 1000 находок, которые достоверно можно считать гомологами выбранного белка (увеличенное изображение - по клику).

2. Поиск сходных последовательностей среди белков из определенной таксономической группы.

Для выполнения этого задания я искала гомологичные последовательности среди бактерий рода Amycolatopsis. Для белка dUTP pyrophosphatase, выделенного из Amycolatopsis mediterranei (WP_013224478.1) я сравнила параметры при поиске по всем организмам и при поиске по некрупной таксономической группе. Все параметры, кроме E-value совпали (это логично, так как они характеризуют выравнивание). А вот E-value показывает, насколько случайна полученная находка, поэтому при поиске по меньшей базе данных это значение должно быть меньше. Так и есть: при поиске по всем организмам E-value данной находки составило 1e-78, а при поиске только по роду Amycolatopsis 3e-81.

3. Карта локального сходства для одной из найденных последовательностей.

Для последовательности deoxyuridine 5'-triphosphate nucleotidohydrolase из организма Loktanella hongkongensis было выполнено выравнивание с исходной последовательностью и получена карта локального сходства для этого выравнивания (рисунок 2).

Рисунок 2. Карта локального сходства для двух выбранных последовательностей.

По карте локального сходства видно, что последовательности совпадают почти на всем протяжении, при этом есть два разрыва линии, соответствующие вставкам/делециям.

4. Использование BLAST для поиска в собственной базе данных.

Для выполнения этого задания была создана собственная база данных из последовательностей, входящих в выравнивание align_13.fasta. Все гэпы предварительно были удалены: database.fasta. Работа выполнялась на сервере kodomo:

makeblastdb -dbtype prot -in database.fasta -out mydatabase
blastp -db mydatabase -query sequence.fasta

Программа выдала только одну находку. Полученное выравнивание представлено на рисунке 3, а параметры для данной находки представлены в таблице 2.

Параметры выравнивания:
Матрица: BLOSUM62
Штраф за открытие гэпа: 11
Штраф за продолжение гэпа: 1
Neighboring words threshold: 11

Рисунок 3. Выравнивание последовательности выбранного белка с белком ALIAD из новой базы данных.

Таблица 1. Результаты поиска гомологов с помощью BLAST для выбранного белка по собственной базе данных.

Находка	Длина выравнивания	bit score	% идентичных колонок	% сходных колонок	E-value
ALIAD	84	16.2	26	38	3.6

И по самому выравниванию, и по его числовым характеристикам (маленький bit score и большое E-value) можно сделать вывод, что совпадения в последовательностях случайны, и белки не являются гомологами. Вообще странно было бы ожидать, что среди восьми случайно выбранных белков найдется гомолог к другому случайно выбранному белку. Хотя, конечно, разное бывает.