PSI-BLAST. Множественное выравнивание

Как и в предыдущем задании, для выполнения практикума была взята аминокислотная последовательность дУТФазы, выделенной из Amycolatopsis orientalis HCCB10007 (YP_008011580.1).
Задача: построить множественное выравнивание последовательностей гомологов.

1. Создание семейства гомологов для выбранного белка с помощью PSI-BLAST.

Для поиска гомологичных последовательностей на сайте NCBI был запущен PSI-BLASTP по базе данных SwissProt. В дополнительных параметрах я установила максимальное количество находок 20000, чтобы увидеть все найденные гомологи. Все остальные параметры были оставлены по умолчанию. На каждой итерации PSI-BLAST выдает список находок, среди которых отмечает те находки, которых не было на предыдущей итерации. По умолчанию для следующей итерации используются находки с E-value < 0.005. В таблице 1 указана информация о каждой итерации.

Таблица 1. Сравнение гомологов для исследуемого белка, найденных BLASTP по базе данных Refseq_protein.

Номер итерации	Количество находок лучше порога	Наличие новых находок	ID лучшей находки	Score лучшей находки	E-value лучшей находки	ID худшей находки*	Score худшей находки*	E-value худшей находки*
1	379		Q82KK4.1	195	1e-61	B8GHN1.1	39.7	0.004
2	661	+	C4L816.1	223	8e-73	A9B2B7.1	39.7	0.005
3	699	+	P43792.1	203	5e-65	P03242.2	48.2	2e-06
4	699	-	P43792.1	196	2e-62	Q6ZN92.1	57.5	9e-10

*для худшей находки выше порога После четырех итераций произошла стабилизация результата, то есть список находок выше порога совпадает со списком последовательностей, поданных на вход. Для "лучшей" неправильной находки E-value составило 1.7, то есть эта ступенька E-value до худшей "правильной" находки довольно большая, поэтому довольно вероятно, что находки составляют семейство гомологичных белков. Последовательности всех найденных находок были сохранены в файл family.txt.

3. Построение множественного выравнивания отобранных последовательностей при помощи программы muscle.

Для отобранных последовательностей с помощью программы muscle на сервере kodomo было построено множественное выравнивание:

muscle -in family.txt -out ali_family.fasta

С полученным выравниванием можно ознакомиться в формате .fasta.

4. Построение множественного выравнивания типичных представителей данного семейства.

Для того, чтобы получить выравнивание небольшого количества типичных белков была использована встроенная функция JalView > Edit > Remove redundancy с порогом идентичности в 95%. В результате получено выравнивание для 10 последовательностей.

5. Построение множественного выравнивания тех же последовательностей при помощи программы mafft.

Для отобранных в предыдущем задании последовательностей с помощью программы mafft на сервере kodomo было построено множественное выравнивание:

mafft seeds.fasta > seeds_mafft.fasta

С полученным выравниванием можно ознакомиться в формате .fasta.

6. Сравнение выравниваний, полученных в заданиях 4 и 5.

Для сравнения двух выравниваний была использована программа muscle на сервере kodomo:

muscle -profile -in1 seeds_mafft.fasta -in2 seeds_muscle.fasta -out ali-ali.fasta

Полученное выравнивание было открыто в JalView и покрашено по группам.

С результатами работы можно ознакомиться в проекте JalView. Довольно большие участки сходства наблюдаются в середине белка (рисунок 1), однако абсолютно консервативных колонок крайне мало. Это может быть связано с разным механизмом действия программ muscle и mafft, например, разной ценой за открытие и продолжение гэпа.

Рисунок 1. Фрагмент выравнивания двух выравниваний, построенных mafft (верхняя группа) и muscle (нижняя группа).