Практикум 14
Сборка генома de novo
1. С помощью команды gzip -d C.fastq.gz был разархивирован файл.
2. Теперь адаптеры.
Команда: java -jar /usr/share/java/trimmomatic.jar SE -phred33 C.fastq outC.fastq ILLUMINACLIP:adapters.fasta:2:7:7,
где adapters.fasta – файл с адаптерами.
В итоге появился файл outC.fastq
Рис.1. Команда для адаптеров
3. Убираем плохие буквы с концов.
Надо пройти скользящим окном (SLIDINGWINDOW) длины 5 по каждому прочтению и убрать части ридов после любого окна со средним качеством ниже 28.
При этом надо удалить те прочтения, которые после очистки окажутся короче 32 букв.
Рис.2. Команда для отбора по качеству
Команда: java -jar /usr/share/java/trimmomatic.jar SE -phred33 outC.fastq outCout2.fastq SLIDEWINDOW:5:28
(отбираем по качеству)
Рис.3. Команда для удаления коротких фрагментов
Команда: java -jar /usr/share/java/trimmomatic.jar SE -phred33 outCout.fastq goodC.fastq MINLEN:32 (картинка старая)
(удаляем короткие)
4. Запуск velveth.
Запустить velveth для создания 31-меров (т.е., параметр hash_length должен быть равен 31). См. руководство пользователя пакета Velvet.
Чтения в нашем случае короткие и не парные (short).
Команда: velveth /nfs/srv/databases/ngs/nastya_lacewing/14 31 -short -fastq goodC2.fastq (картинка старая)
Рис.4. Запуск velveth
Создались: Файлы Log, Roadmaps и Sequences
5.Собираем контиги программой velvetg.
Команда: velvetg .
Рис.5. Запуск velvetg
В итоге создались Graph, PreGraph, LastGraph, contigs.fa, stats.txt (Картинки старые)
6. Информация о запуске velvet.
Как видно из выхода программы "Final graph has 257875 nodes and n50 of 68, max 672, total 5410757, using 0/3525084 reads."
Таким образом N50 - 68, длина самого большого контига - 672. Самое маленькое покрытие - 1.000000, самое большое - 591.813965.
7. Аннотация программой BLAST.
(указать для каждого контига: банковскую аннотацию (организм и описание) лучшей находки, число выравниваний контига с этой находкой, выданных BLAST-ом, характеристики этих выравниваний (покрытие контига, процент идентичности).
a) Большой контиг
Был проведен поиск по BLAST. Находки представлены на изображении. Всего было найдено 41 сходная последовательность.
Рис.6. BLAST и большой контиг
Рис.7. Находки
Рис.8. Выравнивание с лучшей находкой
Таким образом, лучшая находка - "Arabidopsis thaliana myo-inositol oxygenase 2 (MIOX2), mRNA" - мио-инозитол оксигеназа 2 у резушки.
Ссылка на аннотацию в ncbi
б) Контиг с самым высоким покрытием
Был проведен поиск по BLAST. Находки представлены на изображении. Всего было найдено 41 сходная последовательность.
Рис.9. BLAST и контиг с высоким покрытием
Рис.10. Находки
Рис.11. Выравнивания с несколькими лучшими находками
Здесь, выходит, что лучшая находка - ген NHL3, расположенный в 5 хромосоме у резушки. Причем 100% совпадение наблюдается у всех экотипов.
Ссылка на аннотацию в ncbi ("Arabidopsis thaliana ecotype Ms-0 NHL3 (NHL3) gene, partial cds")
в) Контиг с самым низким покрытием
Был проведен поиск по BLAST. Но ничего не было обнаружено. Возможно, этот контиг содержит неточности, потому что покрытие слишком низкое.
Рис.12. BLAST и контиг с низким покрытием
Картинки:
1.Работа velvetg
© Cherkashina Anastasia 2017