Практикум 14

Практикум 14 Сборка генома de novo 1. С помощью команды gzip -d C.fastq.gz был разархивирован файл. 2. Теперь адаптеры. Команда: java -jar /usr/share/java/trimmomatic.jar SE -phred33 C.fastq outC.fastq ILLUMINACLIP:adapters.fasta:2:7:7, где adapters.fasta – файл с адаптерами. В итоге появился файл outC.fastq Рис.1. Команда для адаптеров 3. Убираем плохие буквы с концов. Надо пройти скользящим окном (SLIDINGWINDOW) длины 5 по каждому прочтению и убрать части ридов после любого окна со средним качеством ниже 28. При этом надо удалить те прочтения, которые после очистки окажутся короче 32 букв. Рис.2. Команда для отбора по качеству Команда: java -jar /usr/share/java/trimmomatic.jar SE -phred33 outC.fastq outCout2.fastq SLIDEWINDOW:5:28 (отбираем по качеству) Рис.3. Команда для удаления коротких фрагментов Команда: java -jar /usr/share/java/trimmomatic.jar SE -phred33 outCout.fastq goodC.fastq MINLEN:32 (картинка старая) (удаляем короткие) 4. Запуск velveth. Запустить velveth для создания 31-меров (т.е., параметр hash_length должен быть равен 31). См. руководство пользователя пакета Velvet. Чтения в нашем случае короткие и не парные (short). Команда: velveth /nfs/srv/databases/ngs/nastya_lacewing/14 31 -short -fastq goodC2.fastq (картинка старая) Рис.4. Запуск velveth Создались: Файлы Log, Roadmaps и Sequences 5.Собираем контиги программой velvetg. Команда: velvetg . Рис.5. Запуск velvetg В итоге создались Graph, PreGraph, LastGraph, contigs.fa, stats.txt (Картинки старые) 6. Информация о запуске velvet. Как видно из выхода программы "Final graph has 257875 nodes and n50 of 68, max 672, total 5410757, using 0/3525084 reads." Таким образом N50 - 68, длина самого большого контига - 672. Самое маленькое покрытие - 1.000000, самое большое - 591.813965. 7. Аннотация программой BLAST. (указать для каждого контига: банковскую аннотацию (организм и описание) лучшей находки, число выравниваний контига с этой находкой, выданных BLAST-ом, характеристики этих выравниваний (покрытие контига, процент идентичности). a) Большой контиг Был проведен поиск по BLAST. Находки представлены на изображении. Всего было найдено 41 сходная последовательность. Рис.6. BLAST и большой контиг Рис.7. Находки Рис.8. Выравнивание с лучшей находкой Таким образом, лучшая находка - "Arabidopsis thaliana myo-inositol oxygenase 2 (MIOX2), mRNA" - мио-инозитол оксигеназа 2 у резушки. Ссылка на аннотацию в ncbi б) Контиг с самым высоким покрытием Был проведен поиск по BLAST. Находки представлены на изображении. Всего было найдено 41 сходная последовательность. Рис.9. BLAST и контиг с высоким покрытием Рис.10. Находки Рис.11. Выравнивания с несколькими лучшими находками Здесь, выходит, что лучшая находка - ген NHL3, расположенный в 5 хромосоме у резушки. Причем 100% совпадение наблюдается у всех экотипов. Ссылка на аннотацию в ncbi ("Arabidopsis thaliana ecotype Ms-0 NHL3 (NHL3) gene, partial cds") в) Контиг с самым низким покрытием Был проведен поиск по BLAST. Но ничего не было обнаружено. Возможно, этот контиг содержит неточности, потому что покрытие слишком низкое. Рис.12. BLAST и контиг с низким покрытием Картинки: 1.Работа velvetg

nastya_lacewing@kodomo:/nfs/srv/databases/ngs/nastya_lacewing/14$ velvetg . [0.000001] Reading roadmap file ./Roadmaps [13.069566] 3525084 roadmaps read [13.074688] Creating insertion markers [14.841841] Ordering insertion markers [17.108252] Counting preNodes [18.445220] 1251885 preNodes counted, creating them now [24.595574] Sequence 1000000 / 3525084 [30.520597] Sequence 2000000 / 3525084 [36.326501] Sequence 3000000 / 3525084 [39.530705] Adjusting marker info... [41.462523] Connecting preNodes [43.647650] Connecting 1000000 / 3525084 [45.828360] Connecting 2000000 / 3525084 [48.420296] Connecting 3000000 / 3525084 [50.443201] Cleaning up memory [50.483984] Done creating preGraph [50.484066] Concatenation... [51.201701] Renumbering preNodes [51.201790] Initial preNode count 1251885 [51.365704] Destroyed 697242 preNodes [51.365802] Concatenation over! [51.365817] Clipping short tips off preGraph [51.645467] Concatenation... [51.931252] Renumbering preNodes [51.931310] Initial preNode count 554643 [52.048195] Destroyed 174789 preNodes [52.048255] Concatenation over! [52.048266] 110648 tips cut off [52.048275] 379854 nodes left [52.048421] Writing into pregraph file ./PreGraph... [54.226054] Reading read set file ./Sequences; [55.544843] 3525084 sequences found [61.646247] Done [65.099933] Reading pre-graph file ./PreGraph [65.101395] Graph has 379854 nodes and 3525084 sequences [66.319619] Scanning pre-graph file ./PreGraph for k-mers [67.105382] 6775454 kmers found [68.491144] Sorting kmer occurence table ... [71.994918] Sorting done. [71.994984] Computing acceleration table... [72.127158] Computing offsets... [72.224952] Ghost Threading through reads 0 / 3525084 [72.227348] Ghost Threading through reads 1000000 / 3525084 [72.229748] Ghost Threading through reads 2000000 / 3525084 [72.236254] Ghost Threading through reads 3000000 / 3525084 [72.242212] === Ghost-Threaded in 0.021161 s [72.242310] Threading through reads 0 / 3525084 [82.579861] Threading through reads 1000000 / 3525084 [93.653297] Threading through reads 2000000 / 3525084 [105.653964] Threading through reads 3000000 / 3525084 [114.685998] === Threaded in 42.443723 s [114.713758] Correcting graph with cutoff 0.200000 [114.767308] Determining eligible starting points [115.593066] Done listing starting nodes [115.593151] Initializing todo lists [115.842281] Done with initilization [115.842345] Activating arc lookup table [116.179062] Done activating arc lookup table [116.252501] 10000 / 379854 nodes visited [116.334936] 20000 / 379854 nodes visited [116.444759] 30000 / 379854 nodes visited [116.568464] 40000 / 379854 nodes visited [116.706278] 50000 / 379854 nodes visited [116.870702] 60000 / 379854 nodes visited [117.075387] 70000 / 379854 nodes visited [117.256423] 80000 / 379854 nodes visited [117.487738] 90000 / 379854 nodes visited [117.675395] 100000 / 379854 nodes visited [117.811590] 110000 / 379854 nodes visited [117.940649] 120000 / 379854 nodes visited [118.065364] 130000 / 379854 nodes visited [118.191347] 140000 / 379854 nodes visited [118.323139] 150000 / 379854 nodes visited [118.465467] 160000 / 379854 nodes visited [118.614894] 170000 / 379854 nodes visited [118.761414] 180000 / 379854 nodes visited [118.907452] 190000 / 379854 nodes visited [119.064777] 200000 / 379854 nodes visited [119.210894] 210000 / 379854 nodes visited [119.364163] 220000 / 379854 nodes visited [119.520420] 230000 / 379854 nodes visited [119.676647] 240000 / 379854 nodes visited [119.848178] 250000 / 379854 nodes visited [120.019173] 260000 / 379854 nodes visited [120.205335] 270000 / 379854 nodes visited [120.393453] 280000 / 379854 nodes visited [120.575410] 290000 / 379854 nodes visited [120.764343] 300000 / 379854 nodes visited [120.958745] 310000 / 379854 nodes visited [121.143658] 320000 / 379854 nodes visited [121.318708] 330000 / 379854 nodes visited [121.529430] 340000 / 379854 nodes visited [121.746941] 350000 / 379854 nodes visited [121.954052] 360000 / 379854 nodes visited [122.159835] 370000 / 379854 nodes visited [122.364553] 380000 / 379854 nodes visited [122.577407] 390000 / 379854 nodes visited [122.777648] 400000 / 379854 nodes visited [122.967121] 410000 / 379854 nodes visited [123.154931] 420000 / 379854 nodes visited [123.329678] 430000 / 379854 nodes visited [123.510240] 440000 / 379854 nodes visited [123.712092] 450000 / 379854 nodes visited [123.876773] 460000 / 379854 nodes visited [124.025761] 470000 / 379854 nodes visited [124.177378] 480000 / 379854 nodes visited [124.389389] 490000 / 379854 nodes visited [124.437872] 500000 / 379854 nodes visited [124.485147] 510000 / 379854 nodes visited [124.530304] 520000 / 379854 nodes visited [124.569131] 530000 / 379854 nodes visited [124.604144] 540000 / 379854 nodes visited [124.639056] 550000 / 379854 nodes visited [124.676071] 560000 / 379854 nodes visited [124.705553] 570000 / 379854 nodes visited [124.720811] Concatenation... [124.815571] Renumbering nodes [124.815630] Initial node count 379854 [124.855660] Removed 76313 null nodes [124.855722] Concatenation over! [124.855752] Clipping short tips off graph, drastic [125.374001] Concatenation... [125.498273] Renumbering nodes [125.498325] Initial node count 303541 [125.546596] Removed 45666 null nodes [125.546658] Concatenation over! [125.546690] 257875 nodes left [125.546922] Writing into graph file ./Graph... [127.276814] WARNING: NO COVERAGE CUTOFF PROVIDED [127.276876] Velvet will probably leave behind many detectable errors [127.276886] See manual for instructions on how to set the coverage cutoff parameter [127.276947] Removing contigs with coverage < -1.000000... [127.303856] Concatenation... [127.384021] Renumbering nodes [127.384077] Initial node count 257875 [127.385052] Removed 0 null nodes [127.385069] Concatenation over! [127.409058] Concatenation... [127.491046] Renumbering nodes [127.491096] Initial node count 257875 [127.492094] Removed 0 null nodes [127.492113] Concatenation over! [127.492137] Clipping short tips off graph, drastic [127.515145] Concatenation... [127.594205] Renumbering nodes [127.594262] Initial node count 257875 [127.595283] Removed 0 null nodes [127.595299] Concatenation over! [127.595308] 257875 nodes left [127.595327] WARNING: NO EXPECTED COVERAGE PROVIDED [127.595335] Velvet will be unable to resolve any repeats [127.595344] See manual for instructions on how to set the expected coverage parameter [127.595362] Concatenation... [127.673245] Renumbering nodes [127.673312] Initial node count 257875 [127.674321] Removed 0 null nodes [127.674337] Concatenation over! [127.674349] Removing reference contigs with coverage < -1.000000... [127.699514] Concatenation... [127.777535] Renumbering nodes [127.777603] Initial node count 257875 [127.778583] Removed 0 null nodes [127.778599] Concatenation over! [127.809934] Writing contigs into ./contigs.fa... [128.403973] Writing into stats file ./stats.txt... [129.358465] Writing into graph file ./LastGraph... Final graph has 257875 nodes and n50 of 68, max 672, total 5410757, using 0/3525084 reads
© Cherkashina Anastasia 2017