Практикум #12. BLAST

Описание параметров программы blastp

Ниже, на рисунке 1, изображена страница вводных параметров для программы blastp из семейства компьютерных программ BLAST. Список обозначений:

• #0

  выбор программы, с которой Вы будете работать. Функции этих программ кратко описаны выше.

  ---

• #1

  в текстовое поле можно ввести или аминокислотную последовательность белка, или его AC, или его ID (а ниже, в поле Or, upload file можно также загрузить файл с последовательностью);

• #2

  учитывать в поиске только те аминокислоты Вашей последовательности, от какой по какую указано в двух текстовых полях (по умолчанию учитываются все);

• #3

  в текстовое поле можно ввести название последовательности в данном поиске;

• #4

  можно выставить флажок, чтобы произвести поиск и выравнивание более чем двух последовательностей.

  ---

• #5

  из списка баз данных произвести выбор базы, в которой будет происходить работа;

• #6

  произвести поиск только по указанным в текстовом поле организмам, опционально. Можно выставить флажок exclude, тогда будет происходить поиск только по тем организмам, которые не указаны в текстовом поле;

• #7

  исключить из работы некоторые последовательности, опционально. Исключаемые последовательности можно выбрать, выставив нужные флажки.
  Models (XM/XP): исключить последовательности, аннотации которых сделаны автоматически,
  Non-redundant RefSeq proteins (WP): исключить референсные последовательности (исходники),
  Uncultured/environmental sample sequences: исключить последовательности, полученные из организмов в естественной среде обитания (которые не были выращены в культуре);

  ---

• #8

  произвести выбор алгоритма поиска и выравнивания, выставив соответствующие флажки. Автоматически выставлен флажок blastp (protein-protein BLAST);

• #9

  Начать бластование!!! Результаты можно получить в отдельной вкладке, выставив флажок.

  ---

• #10

  максимальное количество последовательностей, выводимое в результатах работы по данному запросу. Автоматически выбрано число 100;

• #11

  автоматическое регулирование размера слова (это понятие связано с механизмом работы BLAST, смотрите выше по ссылке) для коротких последовательностей. Можно дезактивировать, выставив флажок. Он автоматически выставлен;

• #12

  выставить в текстовом поле максимальное значение E-value (тоже связано с механизмом работы). Отображаются только те результаты, E-value которых меньше заданного. Чем меньше E-value, тем больше максимальный вес в битах, соответственно, тем более идентичные по отношению к исходному запросу будут результаты. Автоматически выбрано число 10;

• #13

  выбрать из списка длину слова (связано с механизмом работы), на которые будет разбиваться заданная последовательность для отсортировки последовательностей из банка, подлежащих проведению среди них поиска. Автоматически выбрано максимальное число 6;

• #14

  ввести в текстовое поле ограничение максимального количества совпадений между данной и искомой последовательностями. Необходимо в том случае, если в результатах содержится очень много сильно идентичных последовательностях, что может привести к тому, что BLAST не сможет вывести менее идентичные, но интересные результаты. Автоматически выставлено число 0, это значит, что никакого отбрасывания сильно идентичных последовательностей происходить не будет.

  ---

• #15

  выбрать из списка матрицу для вычисления очков выравнивания. По умолчанию - BLOSUM62;

• #16

  выбрать из списка тип штрафов за гэпы (пропуски) в выравнивании;

• #17

  выбрать из списка тип автоматического изменения (масштабирования) значений матрицы подстановок.

  ---

• #18

  исключить последовательности низкой сложности (например, аргинин-глицин богатые последовательности, повторы) которые могут привести к неочевидным и нелогичным результатам;

• #19

  производить поиск нетривиальным способом.
  Mask for lookup table only: производить выравнивания согласно сгенерированной хеш-таблицой поиска и только согласно с ней.
  Mask lower case letters: производить фильтрование по строчным символам последовательности (скрыть строчные символы).

Дополнительные материалы

Ниже распологаются изображения трех выравниваний для аминокислотных последовательностей, полученных из BLAST. Выравнивания сделаны в программе  muscle, изображения получены через программу Jalview, раскраска — ClustalX. На каких именно последовательностях производилось выравнивание — описано ниже.

Поиск гомологов

После загрузки аминокислотной последовательности белка HCS_KITSK [E4MYY0 (2Z,6E)-hedycaryol synthase {ECO:0000303 | PubMed:24399794} (HcS {ECO:0000303 | PubMed:24399794}) (4.2.3.187 {ECO:0000269 | PubMed:24399794})] в текстовое поле Enter FASTA sequence(s), смены максимального количества результатов на 20 000 (максимальное возможное количество результатов, оно было выставлено для того, чтобы сравнить результаты с разными E-value) и нажатия на кнопку BLAST появилась веб-страница с результатами.

На ней мы можем увидеть многое. Например, изображение с распределением 100 лучших результатов запроса BLAST (рисунок 5, выше). Здесь мы также получили таблицу с результатами работы BLAST (таблица 1, выше). Всего BLAST нашел 4 562 белка.

Некоторые результаты я отобрал для выравнивания. Всего для дальнейшего исследования я взял 17 белков, которые поделил на 3 группы:

• 1

  выравнивание белка HCS_KITSK с наиболее схожими последовательностями. Процент соответствия (identity) у них выше 70%, E-value меньше 10^-164. Также величина покрытия больше 95%. Здесь нет ни одного инделя (пропусков нет), у первых двух последовательностей даже нет несовпадений (возможно это те же самые белки). У остальных по два инделя.

• 2

  выравнивание белка HCS_KITSK с последовательностями средней степени схожести. Процент соответствия (identity) у них выше 30%, E-value меньше 10^-41. Величина покрытия больше 94%. Гэпов достаточно много.

• 3

  выравнивание белка HCS_KITSK с последовательностями малой степени схожести. Процент соответствия (identity) у них выше 25%, E-value меньше 10^-18. Величина покрытия больше 90%. Гэпов достаточно много.

Результат в таблице gryzunov_hits.xlsx

Карта локального сходства

Для этого задания я выбрал два белка из разных груп с идентификаторами E4ZIZ7_LEPMJ и K1VG04_TRIAC. У этих белков нет ручной аннотации на сайте Uniprot (для этих белков есть только нерецензированные, автоматически аннотированные записи).

Затем получил последовательности этих белков в FASTA-формате и ввел их в текстовое поле Enter FASTA sequence(s), предварительно выставив флажок Align two or more sequences. Нажал на кнопку BLAST и запустил выравнивание двух белков. В результатах получил изображение выравнивания (рисунок 6) и карту локального сходства (Dot Matrix, рисунок 7).

Surely you're joking, Mr. Alexeevsky!

Эту последовательность я подал на вход программе  blastp. На выходе были получены не самые лучшие результаты: количество очков — менее 40, процент покрытия — очень сильно варьируется от 90 до 30, E-value — от 3 до 265, соответствие (identity) — от 33 до 85. Все неизвестные символы BLAST заменял на X.

Изменение входных параметров BLAST

На этот раз я использовал последовательность белка HCS_KITSK. Я производил поиск несколько раз, каждый раз изменяя какой-нибудь один параметр.

Сначала я использовал стандартные параметры и получил 3346 результатов. Затем я попробовал отключить параметр Short queries, тогда я получил 3562 . Список топ–100 результатов не изменился, как и его "свойства" (E-values и так далее). Затем я поставил параметр Expect threshold на 0,001. И получил 3033 результатов, в то же время свойства топ–100 результатов не изменились. После я изменил Word size на 2. На выходе я получил 7187 результатов. Опять же, свойства топ–100 результатов не изменились.

Далее выбрал Matrix – BLOSUM90, на выходе получил 3339 результатов. Это изменение довольно сильно повлияло на E-values не начальных последовательностей, что говорит, что похожесть этих последовательностей очень зависит от ситуации, в которой они были оценены. Когда же переставил этот параметр на BLOSUM45, то получил 5028 результатов. Сразу стало заметно, что E-values стали меньше на 10 порядков. Также я решил испытать матрицы серии PAM–(point accepted mutation matrix). Попробовал для начала PAM30, получил достаточно малое количество результатов – всего 890. E-values увеличились на 20 порядков. На процент идентичности это изменение влияния не оказало. Я также решил испробовать PAM250. Получил 3537 результатов, причем происходит смена мест в топ-10 результатов, E-values увеличиваются в 20 раз, процент соответствия (identity) незначительно падает (на 1–2%)

Напоследок я решил испробовать поля Low complexity regions и Compositional adjustments. Когда я убрал флажок с первого поля, то я получил 3528 результатов, одновременно с этим E-values незначительно выросли. Когда я испытывал последний параметр (выставив No adjustment), то я получил 3064  результатов, опять же, E-value которых было несколько больше.