Семестр 7, автор – Грызунов Никита (nikit00000s)

Практикум 3. Стабилизирует ли лиганд взаимодействующие с ним петли белка? Автоматизация. B-факторы.

Задание 1. На глаз.

Для данного задания я выбрал кристаллические структуры мутантных лиганд-связывающих доменов RORγ (RAR-related orphan receptor gamma) с лигандом (rockogenin) и без:

5x8q - РСА, организм: Homo sapiens, ...2017, разрешение: 2.20 Å, Rfree: 0.241, Ramachandran outliers: 0, side-chain o.: 1.6%, RSRZ o.: 1.1% - с лигандом (в ячейке тетрамер);
5x8w - РСА, организм: Homo sapiens, ...2017, разрешение: 2.30 Å, Rfree: 0.230, Ramachandran outliers: 0, side-chain o.: 0.4%, RSRZ o.: 1.2% - без лиганда (в ячейке мономер).

Немного о RORγ

Retinoid-related orphan receptor gamma (RORγ, рис. 1) - ядерный рецептор (NR). Существует две изоформы: RORγ (ubiquitous) и RORγ t (thymus-specific). У двух изоформ одинаковые лиганд-связывающие домены (LBD), однако различные N-концевые последовательности.

with rockogenin — RORγ с ингибитором рокогенином.

Две изоформы активно влияют на процессы дифференцировки некоторых видов клеток. RORγ подавляет дифференцировку адипоцитов, влияя на чувствительность к инсулину. RORγ t является основным фактором транскрипции, регулирующим дифференцировку клеток Th17 (CD4+ Th17) [1].

Th17 дифференцируются из наивных T-клеток и характеризуются продукцией интерлейкина (IL)-17. Клетки Th17 и (IL)-17 играют ключевую роль во многих воспалительных процессах и аутоиммунных заболеваниях, например, при рассеянном склерозе, воспалительных заболеваниях кишечника, болезни Крона, псориазе и ревматоидном артрите [2].

Кроме того, RORγ t является основным фактором транскрипции, регулирующим продукцию IL-17 у Th17. В клинических испытаниях было показано, что использование антител против IL-17 может помогать больным псориазом. Альтернативой такой сложной терапии может являться использование ингибиторов RORγ. Одним из естественных ингибиторов RORγ является урсоловая кислота (рис. 2A), содержащаяся во многих растениях. Еще одним естественным ингибитором является рокогенин (рис. 2B) - растительный стерол, выделенный из агавы вида Agave gracilipes (EC₅₀ ~ 0,2 μм). Разрабатываются как малые синтетические ингибиторы, так и репрессорные пептиды.

ursolic acid — Ингибиторы RORγ (PubChem). Урсоловая кислота. Рокогенин.

rockogenin — Ингибиторы RORγ (PubChem). Урсоловая кислота. Рокогенин.

В данном задании необходимо сравнить, как повлияло связывание лиганда (рокогенина) на подвижность сайта связывания лиганда в RORγ.

B-factor of structure with ligand — Структуры сайтов связывания рокогенина в экспериментальных структурах RORγ. Выравнивание структур RORγ cо связанным рокогенином и без. Окраска структурам, лиганд - по хим. элементам. Структура RORγ cо связанным рокогенином. Окраска по величине B-фактора. Структура RORγ в свободном состоянии. Окраска по величине B-фактора.

Довольно интересно, что:

Геометрия аминокислотных остатков немного изменяется при связывании лиганда;
Скаффолд почти не изменяется при связывании лиганда, и только на C конце происходят значительные изменения;
B-фактор (на глаз) выше в случае со связанным лигандом.

На самом деле то, что B-фактор оказался выше у связанной структуры - довольно странно. Это можно объяснить тем, что во вкладке "Experiment" у структуры с лигандом средний изотропный B-фактор равен 51.757, а у свободной структуры - 35.654. Это можно объяснить разными условиями опытов - в первом случае использовались детектор RAYONIX MX-300 и синхротрон CLSI BEAMLINE 08ID-1, во втором - детектор ADSC QUANTUM 270 и синхротрон PHOTON FACTORY BEAMLINE BL-17A. Но самое важное - у структуры с лигандом температура, при которой проводились измерения, равнялась 299 K, а у структуры без лиганда - 277 K. Как известно, B-фактор при возрастании температуры также возрастает, и, скорее всего, при одинаковых условиях эксперимента мы бы наблюдали другую картину.

Сессию данного задания можно скачать по этой ссылке.

Задание 2. Не на глаз.

Наука требует строгих доказательств и фактов, а не оценок на глаз. Поэтому воспользуемся функционалом пакета ProDy. У PDB записей есть проблема: у каждой записи свой разброс и среднее значений B-фактора. Поэтому будем сравнивать их z-scor'ы.

Scatter plot of z-scores of b-factors of two structures — Скаттер-plot z-scor'ов B-факторов структуры, связанной с лигандом против свободной структуры.

Можно заметить, что как для остатков центра связывания, так и для других остатков рецептора при связывании лиганда больше остатков имеют пониженное значение z-score B-фактора по сравнению со структурой без лиганда, что и предполагалось в предыдущем задании.

Заходит заяц в магазин. За прилавком стоит волк. Заяц ему: "Насыпьте мне четыреста грамм соли, пожалуйста." А волк тому в ответ: "Слушай, заяц, у меня весы сломались, давай я тебе на глаз насыплю." Ха-ха. Хорошо-хорошо, согласен, не смешно, но зато в тему... Да и по-другому он как-то звучал...

Jupyter-notebook данного графика можно скачать по этой ссылке.

Список литературы

Noguchi, M., Nomura, A., Murase, K., Doi, S., Yamaguchi, K., Hirata, K., Shiozaki, M., Hirashima, S., Kotoku, M., Yamaguchi, T., Katsuda, Y., Steensma, R., Li, X., Tao, H., Tse, B., Fenn, M., Babine, R., Bradley, E., Crowe, P., Thacher, S., Adachi, T. and Kamada, M. (2017) Ternary complex of human RORγ ligand-binding domain, inverse agonist and SMRT peptide shows a unique mechanism of corepressor recruitment.
Genes Cells, 22: 535-551
Huang M, Bolin S, Miller H, Ng HL. RORγ Structural Plasticity and Druggability. (2020)
Int J Mol Sci., 21(15):5329