.jpg)
Для аминокислотной последовательности белка beta-lactamase domain-containing protein бактерии Cyanothece sp. PCC 8801 я составила семейство гомологов, пользуясь PSI-BLAST.
На каждой итерации PSI-BLAST выдает список находок, среди которых отмечает те находки, которых не было на предыдущей итерации. По умолчанию для следующей итерации используются находки с E-value < 0.005. Результаты поиска представлена в таблицах 1 и 2. Стабилизации результата очередной итерации (список находок выше порога совпадает со списком последовательностей, поданных на вход) достигнуто не было, поэтому я выполнила пять итераций. Во время первой итерации было найдено небольшое количество белков (41), при выполнении второй итерации количество находок резко увеличилось до 321, при выполнении третьей итерациии количесво находок так же очень значительно увеличилось до 905. В 4 и 5 итерациях увеличение количества находок стало не таким значительным и стало уменьшаться в последующих итерациях. В пятой итериции ступенька E-value между худшей "правильной" находкой (0.003) и "лучшей" неправильной (0.007) составляет 0.002. Ступенька очень маленькая, поэтому, скорее всего, эти находки не составляют семейство гомологичных белков. В связи с этим я изменила порог E-value отсечения хороших находок с 0.005 по умолчанию до 1e-6. Я взяла именно такой порог E-value, так как в находках первой итерации после белка с E-value = 7e-29 идет белок с E-value = 5e-05. Я решила, что это очень хорошая ступенька E-value между худшей "правильной" находкой и "лучшей" неправильной. Но с этим порогом тоже ничего хорошего не вышло. Я посмотрела на 2 итерацию с порогом E-value = 1e-6. Заметила, что после белка с E-value = 2e-142 идет белок с E-value = 4e-18. Больше нигде не было такой огромной ступени E-value. К тому же, белки выше белка с E-value = 2e-142 имеют одинаковое название, а после него все названия белков абсолютно различны. Поэтому я решила установить порог E-value = 1e-50. Это оказалось успешным. В таблице 3 представлены результаты этого поиска.
Последовательности найденных после пятой итерации белков с E-value = 0.005 в формате
fasta.
Последовательности найденных после третьей итерации белков с E-value = 1e-50 в формате fasta.
Последовательности найденных после третьей итерации белков с начальным белком с идентификатором RNJ_CORGL с E-value = 1e-50 в формате fasta.
Таблица 1. Характеристика итераций с порогом E-value = 0.005.
| № итерации |
Количество находок лучше порога
(E-value < 0,005) |
Количество находок хуже порога
(E-value > 0,005) |
Появились ли новые находки на данной итерации? |
| 1 | 41 | 82 | - |
| 2 | 321 | 390 | Да |
| 3 | 905 | 81 | Да |
| 4 | 963 | 57 | Да |
| 5 | 979 | 37 | Да |
Таблица 2. Характеристика находок с порогом E-value = 0.005.
| № итерации | Находка | Название белка | Организм | Процент идентичных остатков, % | Max score | E-value |
| 1 | Лучшая находка | Ribonuclease J | Synechocystis sp. PCC 6803 substr. Kazusa | 74 | 907 | 0.0 |
| 1 | Худшая находка | Cleavage and polyadenylation specificity factor subunit 3 | Bos taurus | 33 | 43.9 | 0.003 |
| 2 | Лучшая находка | Ribonuclease J | Synechocystis sp. PCC 6803 substr. Kazusa | 73 | 721 | 0.0 |
| 2 | Худшая находка | Ribonuclease Z | Lactobacillus casei ATCC 334 | 24 | 42.7 | 0.005 |
| 3 | Лучшая находка | Ribonuclease J 1 | Staphylococcus aureus subsp. aureus MSSA476 | 43 | 588 | 0.0 |
| 3 | Худшая находка | Metallo-beta-lactamase domain-containing protein 1 | Mus musculus | 21 | 42.8 | 0.005 |
| 4 | Лучшая находка | Ribonuclease J 1 | Staphylococcus saprophyticus subsp. saprophyticus ATCC 15305 | 43 | 538 | 0.0 |
| 4 | Худшая находка | Carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase BlaB-2 | Elizabethkingia meningoseptica | 15 | 42.8 | 0.004 |
| 5 | Лучшая находка | Ribonuclease J 1 | Staphylococcus saprophyticus subsp. saprophyticus ATCC 15305 | 43 | 485 | 2e-162 |
| 5 | Худшая находка | Coenzyme PQQ synthesis protein B; AltName | Klebsiella pneumoniae | 10 | 43.6 | 0.003 |
В таблицах 3 и 4 представлены результаты для находок с порогом E-value = 1e-50. Была получена стабилизация результата в третьей итерации (список находок выше порога совпадает со списком последовательностей, поданных на вход). В третьей итериции ступенька E-value между худшей "правильной" находкой (5e-142) и "лучшей" неправильной (8e-17) огоромна, причем в неправильных находках E-value постепенно снижается без скачков. Из этого можно сделать вывод, что действительно находки составляют семейство гомологичных белков.
Таблица 3. Характеристика итераций с порогом E-value = 1e-50.
| № итерации |
Количество находок лучше порога
(E-value < 0,005) |
Количество находок хуже порога
(E-value > 0,005) |
Появились ли новые находки на данной итерации? |
| 1 | 28 | 95 | - |
| 2 | 30 | 542 | Да |
| 3 | 30 | 534 | Нет |
Таблица 4. Характеристика находок с порогом E-value = 1e-50.
| № итерации | Находка | Название белка | Организм | Процент идентичных остатков, % | Max score | E-value |
| 1 | Лучшая находка | Ribonuclease J | Synechocystis sp. PCC 6803 substr. Kazusa | 74 | 907 | 0.0 |
| 1 | Худшая находка | Ribonuclease J | Pyrococcus abyssi GE5 | 33 | 204 | 5e-57 |
| 2 | Лучшая находка | Ribonuclease J 1 | Staphylococcus aureus subsp. aureus MSSA476 | 43 | 756 | 0.0 |
| 2 | Худшая находка | Uncharacterized protein MG423 homolog | Mycoplasma pneumoniae M129 | 20 | 214 | 1e-59 |
| 3 | Лучшая находка | Ribonuclease J 1 | Staphylococcus aureus subsp. aureus MSSA476 | 43 | 738 | 0.0 |
| 3 | Худшая находка | Ribonuclease J | Pyrococcus abyssi GE5 | 426 | 32 | 5e-142 |
Затем я выбрала белок Ribonuclease J из организма Mycobacterium tuberculosis CDC1551 и провела поиск по нему с аналогичными параметрами. Результаты поиска полностью совпадают с поиском по белку beta-lactamase domain-containing protein бактерии Cyanothece sp. PCC 8801.
Для построения множественного выравнивания отобранных последовательностей я использовала программу muscle на сервере kodomo. Команда: muscle -in my_sequence.fasta -out out_sequence.fasta
При построении множественного выравнивания типичных представителей данного семейства я воспользовалась программой JalView ( JalView=> Edit => Remove redundancy и процент сходных аминокислотных остатков - 68%). В итоге осталось 10 последовательностей белков.
После этого я построила множественное выравнивание тех же десяти последовательностей при помощи программы mafft на сервере kodomo. Команда: mafft my_sequence1.fasta > out_sequence1.fasta
Затем я выровняла полученные два выравниванияс помощью программы muscle. Команда: muscle -profile -in1 out_sequence1.fasta -in2 out_sequence2.fasta -out out_sequence3.fasta. Далее я сравнивала полученные выравнивания в JalView. В выравнивании двух выравниваний одних и тех же последовательностей я отметила участки совпадения (те, на которых остатки в колонках первого выравнивания точно те же, что в колонках второго) символом S. Резуьтат можно увидеть на рис.1. Результат выравнивания выравниваний в jar-файле.
Рис.1 Выравнивание выравниваний. Первые 10 выровнены с помощью программы mafft, вторые десять - с помощью программы muscle. Кликните на изображение для просмотра.
Видно, что в блоках выравнивания выровнены одинаково, а в менее консервативных колонках и где встречаются гэпы выравнивания различаются.