Сборка de novo

Для начала выполнения сборки de novo, был скачан один из проектов по секвенированию бактерии Buchnera aphidicola - SRR4240379.

1. Подготовка чтений программой trimmomatic

С помощью команды cp /mnt/scratch/NGS/adapters/* . в рабочую директорию были скопированы последовательности адаптеров, используемых для ILLUMINA, а командой cat *.fa >> adapters.fa эти последовательости были объединены в один файл.

Остатки адаптеров были удалены с чтений командой java -jar /usr/share/java/trimmomatic.jar SE -phred33 -threads 10 SRR4240379.fastq.gz reads_noad.fatq.gz ILLUMINACLIP:adapters.fa:2:7:7 2> removing.log. Удаленные остатки адаптеров составили 1.76%.

Затем командой java -jar /usr/share/java/trimmomatic.jar SE -phred33 -threads 10 reads_noad.fastq.gz good_reads.fastq.gz TRAILING:20 MINLEN:32 2> trim.log с концов были удалены нуклеотиды с качесвтом ниже 20, а также отобраны чтения длиной не менее 32 нуклеотидов. Из 7269852 чтений удалилось 295585. Оставшиеся очищенные чтения можно использовать в сборке de novo.

Вес исходного файла: 167Mb. Вес после удаления адаптеров: 165Mb. Вес после очистки: 156Mb.

2. Подготовка k-merов и сборка генома

Для получения k-merov длины 31 была запущена команда velveth kmers 31 -fmtAuto -short good_reads.fastq.gz. Hа основе полученных k-merов была составлена сборка генома: velvetg kmers &> velv.log.

Было получено 440 контигов разной длины. В конце log файла содержится информация об N50 получившейся сборки - 25646 нуклеотидов. Информация о получившихся контигах содержится в файле stats.txt, а последовательности контигов находятся в файле contigs.fa. В таблице 1 представлены 3 самых длинных контига. Также интересно появление контигов с аномально большим покрытием, а также контига длины 0. Эти контиги описаны в табл. 2. Помимо этого, многие из получившихся контигов имеют покрытие 1.

3. Анализ

Программой MEGABLAST три самых длинных контига (записаны в отдельные файлы командой seqret) были сравнены с хромосомой Buchnera aphidicola (GenBank/EMBL AC — CP009253). На картинках представлены графики распределения участков контигов на хромосоме и DotPlot проведенных выравниваний. Исследование показывает, что эти контиги действительно соответствуют участкам хромосомы бактерии и получившаяся сборка соответствует действиетльности. Делеции на графиках показывают, что контиги частично покрывают хромосому (участки покрытия указаны в табл. 3). Это может возникать из-за того, что некоторые участки не отсеквенировались.

Табл. 3. Результаты megablast контигов с хромосомой Buchnera aphidicola

ID	Длина	Занимаемые участки хромосомы	Ссылка на выравнивание
Контиг 6	49912	127825 - 140555; 153752 - 161738; 144368 - 151796; 161898 - 166752; 166750 - 173180	6alignment.txt
Контиг 9	49262	500370 - 508806; 510438 - 516539; 523105 - 528679; 481997 - 488106; 517766 - 521500; 496111 - 500325; 493487 - 494864; 480874 - 481545; 528794 - 529211; 495033 - 495148	9alignment.txt
Контиг 5	33085	467412 - 474667; 462496 - 467421; 474844 - 480660; 451729 - 454069	5alignment.txt