Исследование DNA primase small subunit P.furiosus

Введение

Информация о белке

DNA primase small subunit PriS (p41): субъединица ДНК-праймазы, участвующая в процессе репликации ДНК. Данный белок относится к семейству малых субъединиц праймаз эукариотического типа и встречается у Archaea и Eukaryota ^[1]. p41 является каталитическим компонентом в гетеродимере и напрямую осуществляет функции синтеза РНК-праймера и его удлинения. Что интересно, эта субъединица способна самостоятельно синтезировать длинные фрагменты ДНК без матрицы, однако гетеродимер (с большой субъединицей p46) имеет повышенную аффинность к матрице и синтезирует более короткие фрагменты ДНК. ^[2]. В качестве кофакторов p41 выступают Mg²⁺ и Mn²⁺, которые необходимы для связывания NTPs и удлинения цепи соответственно ^[3]

Информация об организме

Основная информация о белке.

Сеансы поиска в UniProt

1. Встречаемость ДНК-праймазы эукариотического типа в трёх доменах жизни.

Запрос: goa:("dna primase activity") family:"eukaryotic-type primase small subunit family" NOT taxonomy:"Archaea [2157]" NOT taxonomy:"Eukaryota [2759]"

По упомянутой в введении принадлежности данной праймазы к Eukaryota и Archaea было решено проверить, встречается ли PriS в иных таксонах жизни. По результатам выдачи запроса было найдено лишь одно совпадение (PRIM_OSHVF) - предполагемая (Inferred from homology) праймаза герпесвируса устриц 1 (OsHV-1, сем. Malacoherpesviridae). Вероятно ген праймазы случайно встроился в геном вируса при сборке вирусных частиц, но данный вопрос требует дальнейшего изучения.

Запрос: goa:("DNA primase activity [3896]") family:primase NOT family:"eukaryotic-type primase small subunit family" NOT family:"eukaryotic-type primase large subunit family"

Данный запрос был направлен на выявление праймаз других семейств. Было выявлено 3 семейства:

• DnaG primase family: широко представленная среди бактерий ДНК-праймаза. Представляет собой мономер и синтезирует короткие РНК-праймеры.^[9]
• Archaeal DnaG primase family: ДНК-праймаза бактериального типа, встречающаяся у Archaea. Действительно, в геноме некоторых архей закодированы и экспрессируются оба типа ДНК-праймаз(бактериального и эукариотического типа).^[10] По дополнительному запросу было установлено, что в геноме P.furiosus также присутствует ДНК-праймаза бактериального типа.(Inferred from homology)
• Herpesviridae DNA primase family: ДНК-праймаза герпесвирусов, встречающаяся в том числе у многих известных представителей данной группы (HHV, CMV, лимфотропный герпесвирус B и др.) . Дополнительно проведенный запрос показал, что у упомянутого выше OsHV-1 (герпесвируса устриц) отсутствует праймаза данного типа, что связано с присутствием в его геноме праймазы эукариотического типа.

2. Цинк-связывающий мотив в структуре ДНК-связывающих белков.

Запрос: annotation:(type:motif "zinc knuckle motif")

Выдача по данному запросу состоит только из малых субъединиц ДНК-праймазы эукариотического типа. Дальнейший поиск направлен на расширение круга белков.

Запрос: NOT goa:("DNA primase activity [3896]") annotation:(type:metal zinc) annotation:(type:function "dna synthesis") keyword:"dna replication"

По данному запросу были получены записи о ДНК-полимеразах Eukaryota, АТФазах WRNIP1 и 2 позиции Unreviewed (фактор сплайсинга Aphanomyces invadans и ДНК-полимераза Geobacillus kaustophilus (strain HTA426)). Внимания заслуживает тот факт, что все белки реплисомы, осуществляющие синтез ДНК, содержат ион цинка в координированном виде. Это действительно подтверждает гипотезу о его роли в данном процессе.

Дополнительно

Интерес для исследования представляет присутствие Zn-связывающего мотива в других организмах/таксонах. Для ответа на этот вопрос был использован портал EMBL-EBI, а именно предоставляемый ими BLASTP. Последовательность PriS P.furiosus была "забластована" на entry UniProtKB/Swiss-Prot. Неудивительно, что в выдаче присутствовали лишь ДНК-праймазы родственных видов. После этого был выбран участок с 91 по 120 аминокислоту, содержащий Zn-связывающий мотив. В результате были получены все те же ДНК-праймазы родственных видов и конотоксины с значительно низким identity. Все вышесказанное может свидетельствовать об уникальности данного мотива для рода Pyrococcus либо о неумении автора пользоваться BLAST'ом.

Анализ гомологичных последовательностей с помощью UniRef

Работа с протеомами

Таксон Archaea на данный момент является крайне малоизученным доменом жизни во многом из-за сложности культивирования и получения образцов. Это объясняется уникальной экстремофильностью представителей: археи обитают в термальных морских источниках(черных курильщиках), особенно солёных водоемах(соляные озера, моря), источниках с высоким или низким pH^[12]. В нижеприведенной части для сравнения с гипертермофильным P.furiosus был выбран крайне галофильный Halobacterium salinarum с целью выявить сходства и различия приспособлений к обитанию при высокой температуре и солёности соответственно.

Анализ представленности белков разных функциональных групп

Белки с ферментативной активностью

В данном разделе приведено сравнение представленности белков различных классов у выбранных видов архей. Для поиска использовался UniProtKB, ссылки на запросы приведены в таблице(под количеством белков в каждом КФ). Дополнительно были рассчитаны доли белков в протеоме (приведены в скобках)

Организм	КФ1	КФ2	КФ3	КФ4	КФ5	КФ6	КФ7	Общее количество
P.furiosus	65 (3,18%)	141 (6,89%)	92 (4,50%)	48 (2,35%)	23 (1,12%)	57 (2,79%)	5 (0,24%)	431 (21,08%)
H.salinarum	97 (4,00%)	210 (8,66%)	116 (4,78%)	63 (2,60%)	34 (1,40%)	67 (2,76%)	11 (0,45%)	598 (24,65%)

Основная часть классов ферментов представлена одинаково у двух видов, однако относительно значимые различия наблюдаются в полях КФ2(трансферазы) и КФ7(транслоказы). Различия в представленности трансфераз может быть объяснена гиперсалинными условиями обитания H.salinarum, так как одним из способов приспособления является присутствие в клетке большого количества мембранных переносчиков, выкачивающих излишек анионов. Для H.salinarum дополнительно описаны уникальные K⁺-переносчики: KdpFABC P-type ATPase и др.^[13] Связь представленности трансфераз и среды обитания не так очевидна.

Трансмембраные белки

По поисковым запросам UniProtKB(указаны в названии археи) для H.salinarum и P.furiosus был произведен анализ представленности трансмембранных белков в протеоме. Результаты выдачи приведены в таблице.

Организм	Кол-во записей	Доля в протеоме	Присутствие бактериородопсина
P.furiosus	117	5,72%	-
H.salinarum	464	19,13%	+

Из полученных выводов видно, что в протеоме H.salinarum присутствует большее количество трансмембранных белков, чем у P.furiosus. Данный факт кореллирует с приспособлением организмов к гиперсалинным местообитаниям: осмолярность цитозоля таких видов гораздо выше нормы и соответствует окружающей среде, и, дополнительно, в клетке экспрессируется большое число трансмембранных ионных каналов, помп и насосов, которые активным транспортом выкачивают избыток ионов.^[13] Дополнительно, для H.salinarum описан уникальный вид аноксигенного фотосинтеза - светозависимая ретиноид-содержащая протонная помпа бактериородопсин , которая осуществляет создание протонного градиента для синтеза АТФ.^[14] Фотосинтетический аппарат включает в состав большее количество трансмембранных белков, и поэтому их доля в протеоме выше.

Биохимические характеристики

Для исследования особенностей выбранных архей было решено проанализировать температурные особенности ферментов. Благодаря предварительному сеансу поиска в UniProtKB было установлено, что для белков H.salinarum отсутствует информация об их температурной устойчивости (раздел Temperature dependence поля CC). Для P.furiosus были скачаны все entry ферментов, содержащих информацию о Temperature dependence (с помощью поиска). Для дальнейшего получения информации использовался скрипт Python. По результатам были получены значения в 70-100°C, что говорит о приспособленности организма к гипертермофильным условиям на биохимическом уровне.

Дополнительная информация

История изменений записи (entry) в UniProt

Запись о PriS P.furiosus была внесена в UniProtKB/TrEMBL 1 октября 2000 года на основе экспериментальных данных (1: Evidence at protein level). 1 мая 2001 года она была обновлена , а 27 апреля 2001 года - внесена в UniProt/Swiss-Prot (то есть получила статус Reviewed). Запись суммарно модифицировалась 116 раз (последний: 7 апреля 2021). В целом, запись редактировалась параллельно с развитием баз данных: вносились новые Cross-references, ссылки, связанные публикации. Однако следует обратить внимание на динамику редактирования информации о Zn-связывающем мотиве. До 61ой версии записи участок связывания цинка значился в поле FT как ZN_FING, однако после модификации это "звание" было изменено на MOTIF. Вероятно, в ходе исследования было установлено, что данный участок не относится к позициям в существующей классификации Zn-fingers, поэтому ему было присвоено более размытое название - мотив. (сплошная головная боль с этим мотивом, чесслово)

REFERENCES

1. Информация о белке в UniProt
2. Liu L. et al. The Archaeal DNA Primase: biochemical characterization of the p41-p46 complex from Pyrococcus furiosus. // Journal of Biological Chemistry. – 2001. – Т. 276. – №. 48. – С. 45484-45490.
3. Keen B. A. et al. Molecular dissection of the domain architecture and catalytic activities of human PrimPol // Nucleic acids research. – 2014. – Т. 42. – №. 9. – С. 5830-5845.
4. Cavalier-Smith, T., Chao, E.EY. Multidomain ribosomal protein trees and the planctobacterial origin of neomura (eukaryotes, archaebacteria)// Protoplasma 257, 621–753 (2020).
5. Schut G. J. et al. The order thermococcales and the family thermococcaceae // The Prokaryotes: Other Major Lineages of Bacteria and the Archaea. – 2014. – С. 363-383.
6. Fiala G., Stetter K. O. Pyrococcus furiosus sp. nov. represents a novel genus of marine heterotrophic archaebacteria growing optimally at 100 C // Archives of Microbiology. – 1986. – Т. 145. – №. 1. – С. 56-61.
7. Augustin M. A., Huber R., Kaiser J. T. Crystal structure of a DNA-dependent RNA polymerase (DNA primase) // Nature structural biology. – 2001. – Т. 8. – №. 1. – С. 57-61.
8. Martínez-Jiménez M. I. et al. The Zn-finger domain of human PrimPol is required to stabilize the initiating nucleotide during DNA priming //Nucleic acids research. – 2018. – Т. 46. – №. 8. – С. 4138-4151.
9. Bocquier A. A. et al. Archaeal primase: bridging the gap between RNA and DNA polymerases //Current Biology. – 2001. – Т. 11. – №. 6. – С. 452-456.
10. Liu B. et al. A primase subunit essential for efficient primer synthesis by an archaeal eukaryotic-type primase //Nature communications. – 2015. – Т. 6. – №. 1. – С. 1-11.
11. Krishna S. S., Majumdar I., Grishin N. V. Structural classification of zinc fingers: survey and summary //Nucleic acids research. – 2003. – Т. 31. – №. 2. – С. 532-550.
12. Baker B. J. et al. Diversity, ecology and evolution of Archaea //Nature microbiology. – 2020. – Т. 5. – №. 7. – С. 887-900.
13. Gunde-Cimerman N., Plemenitaš A., Oren A. Strategies of adaptation of microorganisms of the three domains of life to high salt concentrations //FEMS microbiology reviews. – 2018. – Т. 42. – №. 3. – С. 353-375.
14. Gonzalez O. et al. Systems analysis of bioenergetics and growth of the extreme halophile Halobacterium salinarum //PLoS Comput Biol. – 2009. – Т. 5. – №. 4. – С. e1000332.