Изучение представленности сайтов рестрикции

Данная работа посвящена ознакомлению с возможностями базы REBASE, а именно - изучению представленности сайтов системы рестрикции-модификации II типа в геноме бактерии.

Системы рестрикции-модификации (RM) служат механизмом клеточной защиты от вирусов, позволяющим бактерии уничтожать чужеродную ДНК, попавшую в клетку. Все системы RM делятся на 3 типа, самый представленный из которых - тип II, представлен метилазами и эндонуклеазами рестрикциями, работающими вместе. ^[1]

Подготовка данных к работе

В базе данных REBASE был выбран Flexibacter (Bernardetia) litoralis DSM 6794 - анаэробная Грам-отрицательная бактерия, выделенная из фильтра морского аквариума.^[2]
Ее полный геном был скачан из БД NCBI Assembly (ASM26550v1).

В геноме исследовалась представленность сайтов, узнающихся системой RM II-типа. С полным списом возможных сайтов можно ознакомиться по ссылке.
Для начала, приведем рестриктазы II-типа с известными сайтами, чье наличие в геноме точно подтверждено по данным REBASE

Процедура поиска

1. Первым делом необходимо получить последовательности сайтов рестрикции длиной больше 2 нуклеотидов из исходного файла. Для этого был написан скрипт на Python. С полученными последовательностями можно ознакомиться по ссылке.
2. Полученные последовательности и геном бактерии были переданы онлайн-сервису CB Calc, который оценивает представленность определенных последовательностей в геноме по методу С.Карлина ("method of Burge and co-authors" в программе). Программа выдает файл, содержащий информацию о представленности сайтов в геноме.
3. Для выбора "недопредставленных" сайтов был выбран рекомендуемый порог O/E ratio в 0.8. Отбор осуществлялся с помощью скрипта, который в результате выдает файл с последовательностями недопредставленных сайтов.
4. Наконец, необходимо получить список экспериментально проверенных эндонуклеаз, сайты которых недопредставлены в геноме M.aerguinosa. Для этого был написан скрипт, который учитывает колонку 'Putative' в исходном файле и находит название рестриктазы в REBASE, которой соответствует найденный CB Calc сайт.

Результат: файл, содержащий названия и соответствующий сайт рестриктаз, которые, предположительно, недопредставлены в геноме.

Поиск гомологов в геноме

Финальным этапом данной работы является поиск в геноме бактерии гомологов рестриктаз с недопредставленными сайтами. Для этого, первым делом, необходимо подготовить файл с последовательностями нужных рестриктаз.
Из файла с последовательностями всех рестриктаз II-типа с помощью скрипта были выбраны рестриктазы, чей сайт недопредставлен в геноме. С полученными последовательностями проводился поиск blastp, ограниченный по организму B. litoralis DSM 6794. С результатом можно ознакомиться по ссылке.
Общее количество находок крайне низко, причем подавляющее большинство рестриктаз не имеет ни одного гипотетического гомолога. Только для 10 рестриктаз из 69 в запросе был найден хотя бы 1 гомолог.

Найденные белки сведены в таблицу ниже:

Query	Hits
Lph2132ORFBP	hypothetical protein (WP_014798048.1)
Pin14ORF1619P	! HincII family type II restriction endonuclease (WP_014797179.1)
SspUCH001ORFAP	! HNH endonuclease (WP_157698953.1) hypothetical protein Fleli_2332 (AFM04705.1)
SsuLS9NORFFP	PAS domain-containing protein (WP_014797062.1)
TpeTA4ORF1280P	hypothetical protein (WP_014799424.1)
UbaSCBORF5587P	hypothetical protein (WP_014799424.1)
Vsp6RORF2130P	! NgoPII family restriction endonuclease (WP_014796977.1)
WchORF8360P	! HpaII family restriction endonuclease (WP_217192962.1)
Wsp55ORF1947P	! Eco47II family restriction endonuclease (WP_014797669.1)
Zfo19928ORFJP	7 находок-метилаз ! DNA (cytosine-5-)-methyltransferase (WP_014798050.1, WP_014797670.1, WP_014796976.1, WP_014798147.1, WP_014798051.1, WP_081485499.1, WP_014798035.1)

Как видно, среди находок присутствуют гипотетические белки, эндонуклеазы и 1 метилаза, что позволяет сделать предположение об отсутствии у бактерии подавляющего числа рестриктаз, чьи сайты недопредставлены в геноме, однако наличии некоторых гомологичных белков, чьи сайты все равно недопредставлены.

PSI-BLAST

Из предложенного списка выбран случайный идентификатор O05886. Данный ID имеет 'Ribosome hibernation promotion factor' - фактор, инициирующий гибернацию рибосом (перевод их в неактивное состояние) у бактерии Mycobacterium tuberculosis.
Гибернация рибосом - механизм, позволяющий бактериям длительное время находиться в состоянии покоя c сохраненными рибосомами. Связывание субъединиц рибосом с HPF защищает их от деградации, поэтому при переходе в активное состояние бактерия может использовать "старые" рибосомы и не синтезировать новые.^[3]

Данный белок был использован для запуска PSI-BLAST. Результаты запусков итераций приведены в таблице ниже.

№ итерации	Число находок выше порога (0,005)	ID худшей находки выше порога	E-value этой находки	ID лучшей находки ниже порога	E-value этой находки
1	20	P17161.1	0.003	P17160.1	0.005
2	27	P71346.3	1e-11	нет	-
3	29	P06727.4	0.003	P33621.1	0.007
4	38	P02651.2	0.0002	O46409.1	0.007
5	46	P32918.2	0.004	O42296.1	0.008
6	136	A0A6P6DKR7.1	0.005	P0DKW8.2	0.005

Первая итерация PSI-BLAST является обыкновенным BLAST'ом, поэтому разницы в E-value между лучшей и худжей находкой не наблюдается. Дальнейшие итерации учитывают PSSM, построенную по находкам, которая вносит вклад в расчет E-value новых находок (поэтому он значительно меньше).

Как видно из таблицы, увеличение числа итераций (>2) не привело к стабилизации числа находок. С каждой новой итерацией число находок и E-value худшей из них увеличиваются. Это объясняется постепенным учетом все более разнородных белков, что увеличивает "простор" для нахождения новых белков.

Такое явление позволяет сделать вывод о низкой консервативности этого семейства либо наличие сходных участков последовательности в другой группе белков. Видимо, семейство не такое специфичное и сходные белки встречаются в большом числе видов.

References

1. Sitaraman R. The role of DNA restriction-modification systems in the biology of Bacillus anthracis // Frontiers in Microbiology. – 2016. – Т. 7. – С. 11.
2. Hahnke, R. L., Meier-Kolthoff, J. P., García-López, M., Mukherjee, S., Huntemann, M., Ivanova, N. N., Woyke, T., Kyrpides, N. C., Klenk, H. P., & Göker, M. (2016). Genome-Based Taxonomic Classification of Bacteroidetes. Frontiers in microbiology, 7, 2003. https://doi.org/10.3389/fmicb.2016.02003
3. Theng S., Williamson K. S., Franklin M. J. Role of hibernation promoting factor in ribosomal protein stability during Pseudomonas aeruginosa dormancy //International journal of molecular sciences. – 2020. – Т. 21. – №. 24. – С. 9494.