Практикум 4.

Мне были выданы файлы с хроматограммами прямой 14_F.ab1 и обратной 14_R.ab1 последовательности. Для работы с хроматограммами я выбрала программу UGENE.

Результат - консенсусную последовательность в формате fasta.
Выравнивание прямой и обратной последовательностей в формате fasta.

Так как программа всего лишь распознает пики флюоресценции, она может делать ошибки, связанные с нечеткими или нечитаемыми пиками хроматограммы. Для прямой последовательности нечитаемый участок составил приблизительно 30 нуклеотидов с 5'-конца и 3 нуклеотида с 3'-конца. Для обратной - 70 и 2 нуклеотида соответственно. В целом, качество всей хроматограммы удовлетворительное (могло быть хуже, но и лучше тоже). Уровень шумов колеблется и в середине хроматограммы от низкого до такого, что не понятно, что происходит. Высота пиков также очень непостоянна, но у цитозина (С) пики достигали максимальных значений по сравнению с остальными нуклеотидами.
Выровненная интерпретация двух последовательностей была вручную отредактирована в сложных "спорных" позициях. Рассмотрим некоторые из таких проблемных нуклеотидов.

• Позиция 135 (Рис.1): в этом случае для обратной последовательности был ярко выражен пик флюоресценции тимина, а для прямой последовательности друг на друга наложились пики тимина и аденина. В данном случае по обратной цепи проблемный нуклеотид N был заменен на Т вручную.
• Позиция 176 (Рис.2): ситуация, похожая на первую. В обратной последовательности наблюдается отчетливый пик гуанина, а на прямой смешанные пики находятся на уровне шумов. Проблемный нуклеотид также был устранен благодаря сравнению со второй последовательностью.
• Позиции 505-507 (Рис.3): ситуация такая, что три нуклеотида подряд точно определены для обратной цепи, а на прямой в этом месте образовался шум от последующего тимина, который помешал распознаванию пиков нклеотидов ACG.
• Позиция 489 (Рис.4): эта позиция является единственной для данной секвенируемой последовательности, в которой я смогла определить полиморфизм. И для прямой, и для обратной последовательности в этом месте различимы пики G и C, но для прямой эти пики очень малы. По таблице вырожденных нуклеотидов такая позиция была обозначена как S.

Из 5'-конца обратной последовательности 14_R.ab1 был выбран нечитаемый фрагмент (рис.5)
Сразу видно, что проблема в интерпретации этого участка заключается не в отсутствии пиков, а наоборот, в том, что их слишком много. Если долго смотреть на данный участок хроматограммы, создается впечатление, что все затекло цитозином, потому как именно его пиков здесь больше всего, они максимальны и мешают распознаванию других нуклеотидов. Но надо отметить, что такая картина типична для концевых участков хроматограммы последовательности.

В ходе практикума я научилась пользоваться программами, визуализирующими хроматограммы, полученные при секвенировании нуклеиновых кислот, а так же интерпретировать значения пиков флюоресценции этих хроматограмм, что безусловно очень важно для меня.