Практикум 7. Связывание лигандов. Карманы связывания. Индуцированное соответствие

В этом практикуме я изучала 2 структуры белка - связанную с лигандом и свободную. На рис. 1 голубым покрашена свободная структура, коричневым - связанная.

Из рис.1 и 1b видно, что связывание лиганда немного меняет конформацию белка. В основном, немного смещается та часть белка, которая ближе к сайту связывания - одна альфа спираль и бета-лист. В связанном состоянии альфа спираль и бета-тяжи немного отодвигаются в сторону от лиганда на 1-2 ангстрем, а в самом отдаленном бета-тяже - на 3.1, хотя бета лист который находится рядом с лигандом ближе в альфа-спиральному домену, сдвигается в ту же сторону что и другие бета-тяжи - т.е. подвигается ближе к лиганду. На уровне боковых радикалов аминокислот в сайте связывания лиганда также происходят изменения (рис.2). Сильнее всего изменяется положение аспартата-194, валина-60, лейцина-52. Более детально эти остатки показаны на рис.5. Максимальное отклонение аспартата-194 составляет 2 ангстрема, причем в свободной конформации он отклоняется в сторону центра кармана связывания, а в присутствии лиганда - в обратную сторону, увеличивая радиус кармана. Примечательно, что данный остаток и 2 других не образуют водородных связей с молекулой лиганда, т.е. изменение его положения может влиять на способность лиганда покидать карман с помощью диффузии. Кроме того, два других остатка смещаются в ту же сторону, что и данный аспарагин. Аспартат в свободной конформации может также препятствовать проникновению лиганда внутрь сайта связывания. Изменения в конформации белка, по-видимому, связаны именно с появлением в кармане лиганда.
Если посмотреть на остатки во вторичных структурах (рис.1с), которые сильнее всего сместились, можно заметить, что они буквально просто сместились все в одну сторону и каких-то новых взаимодействий я не смогла найти. А если у остатков и меняются углы, то новых взаимолействий все равно нет, так как такие остатки оказываются на поверхности белка (рис. 1d).

В самом сайте связывание изменение конформации в некоторых случаях можно обьяснить появлением связей с лигандом. Например, на рис. 1e показано расстояние между взаимодействующими атомами лиганда и остатка цистеина-129. В свободной форме этот остаток отдаляется от кармана на прмиерно 0.9 А. Но такое взаимодейсвтие, возможно, не совсем обьясняет изменение конформации на 3 А в других участках белка. Также на рис. 1f показано взаимодействие с другим атомом лиганда, однако оно возникает в основном из-за поворота функциональной группы аспарагина-136 и тоже не обьясняет смещение белка.

Вернемся к аспартату-194, о котором говорилось выше. Как уже говорилось, он не образует водородных связей с лигандом и отклоняется от центра кармана при связывании лиганда. Исходя из того, что можно увидеть на рис.1j, можно предположить, что в свободной форме остаток аспартата-194 может спокойно расположиться в кармане и, возможно, взаимодействовать с остатком лизина, однако при связывании лиганда, аспартат отклоняется подальше, где может взаимодействовать с остатком глицина-196, который, кстати не меняет конформации, а лизин теперь может взаимодействовать с лигандом и тоже практически не меняя свое положение.

Из файла pdb со связанным лигандом я удалила строки, связанные с лигандом, загрузила этот файл в сервис POCASA и получила файл. Топ-5 полученных карманов показаны на рис. 6 разными цветами. То же я проделала со "свободной" структурой. Топ-5 ID карманов для этой структуры: 180, 18, 159, 56, 387.

Полость, в которой находится лиганд соответствует карману 192,т.е. первому в топе. Остальные карманы, как мне кажется, тоже хорошо соответсвуют полостям на поверхности белка. Сравнивая карманы на рис. 6 и 7, можно заметить, что 1-ый в топе карманов (черный) частично совпадает у белка, связавшего лиганд, и у белка без лиганда. У структуры на рис. 6 этот карман кажется меньше, чем на рис. 7, однако можно предположить, что при изменении конформации карман с ID 393 (зеленый) расширяется и становится частью кармана-180. Возможно, это связано с тем, что в закрытой конформации с лигандом карман сужается для того, чтобы сильнее связать лиганд,м а затем карман становится больше, чтобы повысить вероятность того, что лиганд попадет в этот карман. Можно также предположить, что карман 372 и 387 это один и тот же карман, но из-за конформационных изменений, при связывании лиганда этот карман немного расширяется. Синие и розовые карманы не совпадают между собой по расположению и, возможно, соответсвуют нефункциональнозначимым полостям на поверхности белка. Также карман-159, возможно, образуется из 148-ого при изменении конформации. что карман

В представленных выше таблицах показаны параметры карманов для двух структур. Обьем самой большой полости, в которой связывается лиганд, у белка с лигандом равен 309, а без лиганда - 380. Даже если учитывать обьем кармана-393 (объем 40), как часть кармана-180, то объем кармана без лиганда получается больше. Это можно обьяснить "стягиванием" лигандом остатков белка. Можно предположить, что когда лиганд попадает в карман, он сначала стягивает остатки в сайте связывания, а это приводит к конформационному изменению остального кармана и всего белка.

Для выполнения докинга сначала нужно добавить водороды в структуру белка в свободной конформации и в структуру лиганда, взятого из pdb файла белка, связанного с лигандом. Протонированная структура белка была получена с помощью сервиса PDB2PQR. Лиганд я протонировала через SPORES (рис. 8-9).

Докинг производился с помощью сервиса Webina. Были получены 9 возможных поз лиганда, изображенные на рис. 10. Такой позы, которая бы совпадала с той, которая получена из структуры белка с лигандом. Возможно, это связано с тем, что та поза, которая есть в связанном белке, пересекает поверхность кармана в белке, поэтому лиганд не может располагаться в двух конформациях белка в одной позе.

В выдаче Webina позы располагаются по мере убывания афинности (в ккал/моль), первая позиция соответсвует аффинности -9.4 ккал/моль. С помощью PoseView были получены диаграммы взаимодействия лиганда и белка для позы 1 (рис.12) и истинной позы из bound.pdb (рис. 13).

Сравним полученные диаграммы. Можно заметить, что, согласно PoseView, лиганд на рис. 12 и 13 взаимодействует с 3 остатками белка, причем два из них совпадают и один различаются. Лиганд в позе-1, полученной при докинге, взаимодействует с остатком цистеина-129, а в истинной позе он образует водородную связь с остатком цистеина-193. Аспартат-197 и цистеин-129 могут быть первоначальными "якорями" в процессе связывания лиганда, задерживая диффундирующий мимо лиганд, тем самым инициируя замыкание дополнительных связей. Примечательно, что хотя положение лигандов, в целом, не совпадает, расположение 6 и 5 членного азотсодержащих циклов, с которыми происходит взаимодействие, почти не изменяется. Это может означать, что индуцированного соответствия в данном случае нет, а есть вызываемые связыванием лиганда конформационные перестройки, которые могут иметь функциональное значение.

Я еще немного проанализировала расположение атомов в сайтах связывания лигандов в свободной и связанной форме. Одно из взаимодействий, которое нашел PoseView, а именно с аспартата-127, я, к сожалению, не замечала ранее. Но есть одно взаимодействие с остатком аспарагина-136, которое, как мне кажется, может играть функционально значимую роль в процессе связывания и координации лиганда, PoseView это взаимодействие не определил. Хотя в той позе 1, образование водородной связи между аспарагином-136 и лигандом врядли возможно, так как расстояние между атомами 3.9 А, но в истинной позе это расстояние меньше. Интересно также, что при выполнении 1 задания я обращала внимание на цистеин-193, но в истинной позе лиганд не может с ним взаимодействовать, а теперь оказывается, что при инициализации связвания может.