Взаимодействия, субстратная специфичность

Задание 2. Pymol mutagenesis

В этом задании было дано два комплекса антитело-пептидный антиген, где одну позицию субстрата заменили на глицин, используя команду Pymol mutagenesis надо было предположить, какой остаток был в исходной молекуле. Возьмем первый комплекс и посмотрим, куда должен смотреть радикал этого остатка, сделав замену на аланин:

Рис.1 Общий вид окружения промутированного остатка.

На рис.1 мы видим, что для непосредственного взаимодействия с ближайшими остатками белка, боковая цепь промутированного остатка пептида должна быть немаленькой, также наличие кислородов остова остатков аспартата и лизина, как и радикала первого остатка (аспартата), наводит на мысль о лизине и аргинине.

Промутируем и посмотрим на результат:

Рис.2 Мутация на лизин, показан самый представленный в PDB ротамер с напряженностью 26,69, водородные связи выделены желтым цветом, солевой мостик циановым.

Среди возможных самым представленным оказался ротамер на рис.2 с вероятностью встретить его в PDB 33,6%, что сильно больше, чем для других ротамеров, напряженность 26,69 тоже оказалась одной из самых минимальных. Посмотрев глазами, мы можем сказать, что ожидаемый солевой мостик с боковым остатком аспартата вероятнее всего наблюдается именно для этого ротамера, хотя расстояние все же превышает 5 ангстрем, то же можно сказать про водородные связи с кислородами остова, где они составили 3,8 (немного превышает обговоренное 3,5) и 2,5 ангстрем. Можно предположить также гидрофобные взаимодействия между -CH2- группами лизина, тирозина и радикалом аланина.

Теперь посмотрим к чему приведет замена на аргинин, тоже способному к образованию водородных связей и солевых мостиков:

Рис.3 Замена на аргинин, самый представленный в PDB ротамер с напряженностью 31,68, водородные связи выделены желтым цветом, солевой мостик циановым.

На рис.3 показан самый представленный в PDB ротамер с вероятностью 16,6%, в этом случае для всех ротамеров наблюдались большие стерические затруднения, то есть остаток вписывался с большой напряженностью. При этом расстояние до боковой группы аспартата сильно меньше не стало (5,3 ангстрем), а водородная связь с кислоородом лизина уже представляется маловероятной. Гидрофобные взаимодествия также кажутся намного хуже.

Если обратить внимание на мелькающую рядом с аминокислотными остатками антитела молекулу воды, которая, скорее всего, формирует водородные связи с боковой группой аспартата и кислородом остова лизина, можно предположить, что нам нужен остаток, который был бы донором или акцептором (но вероятнее, все же, донором, потому что по геометрии и наиболее вероятному протонированному состоянию аспарагиновой кислоты, которая экспонирована в раствор на поверхности белка, молекула воды двумя водородами смотрит на кислороды этих остатков) водродной связи для образования водяного мостика с молекулой белка, при этом, как мы можем судить по расстоянию до молекулы воды, это должен быть не очень длинный радикал. Посмотрим вначале на серин:

Рис.4 Замена на серин, ротамер с напряженностью 36,07 c самым маленьким расстоянием до кислорода воды.

В этом случае, однако, ротамер с самым коротким расстоянием до молекулы воды оказался самым непредставленным в PDB и с самой большой стерической наряженностью 36,07, да и расстояние едва подходит для образования водородной связи по критерию меньше 3,5 ангстрем. Для треонина расстояние оказалось еще больше, по той же логике можно отбросить цистеин. Для аспарагиновой и глутаминовой кислот ситуация в принципе возможна, но, учитывая их вероятную депротонированность, количество водородных связей будет не макисмально возможным (две из трех).

Рассмотрим вероятность замены на глутамин и аспарагин:

Рис.5 Замена на аспарагин (сверху), ротамер с напряженностью 38,9, и глутамин (снизу), ротамер с напряженностью 32,19.

Здесь на рисунке 5 мы видим наиболее вероятные для образования водородной связи с водой ротамеры для аспарагина и глутамина, в первом случае это не самый представленный ротамер в PDB (9/10), но по углам и связям кажется самым благоприятным, хотя и возникает некоторый клэш с кислородом воды, но мы видим возможность двух водородных связей. Во втором варинате для глутамина был выбран ротамер, также способный к образованию двух водородных связей, но здесь снова наблюдаются клэши с водой и углы (далеко) не самые идеальные, правда, представлен он уже 3/10. Для гидрофобных остатков в данном случае окружение не самое благоприятное, и они сразу были исключены из рассмотрения, для совсем громоздких остатков, возможных участников водородной связи, таких, как тирозин и гистидин, наблюдались слишком большие стерические затруднения. Итого из всех рассмотренных вариантов самым благоприятным можно считать лизин, у которого наблюдаются две водородные связи и возможный солевой мостик, для которого при этом таких больших клэшей, как в случае аспарагина, глутамина и аргинина не наблюдается, где также можно выявить гидрофобные взаимодействия. По моему мнению, остаток Q/13 это лизин.

Для второй пары антиген антитело снова посмотрим вначале на ориентацию радикала:

Рис.6 Общий вид окружения промутированного остатка.

На рис.6 мы видим, что в этом случае в глаза бросается много вариантов, причем, гидрофобные остатки мы тоже сразу исключаем из-за окружения, первый - это остаток серина или треонина, который может вступать в водородные связи с остовами аланина и тирозина:

Рис.7 Мутация на серин, ротамер с напряженностью 10,30.

В случае серина нам подходит ротамер по представленности 2/3 с напряженностью 10,30, однако тут сразу бросается в глаза вакуум между этим остатком и остатками аргинина и тирозина, что будет наблюдаться и у треонина, поэтому его мы уже не рассматриваем и считаем такие варианты не самыми благоприятными.

Отталкиваясь от этого самого вакуума и наличия рядом с этим пространством аргинина и тирозина, мы ожидаем следующую картину: от тирозина это может быть стекинг, пи-катионные (но в нашем случае близость к положительно заряженному аргинину совсем не способствует такому раскладу) и пи-водородные взаимодействия, от аргинина это солевой мостик (но опять-таки близость к пи-системе не очень этому благоприятствует), водородные связи и взаимодействия с пи-системой. То есть у нас может быть гистидин и тирозин (стекинг плюс водородные взаимодействия), аспарагин и глутамин (водородные и пи-водородные взаимодействия). Начнем с глутамина и аспарагина:

Рис.8 Замена на глутамин, ротамер с напряженностью 14,58, водородные и пи-водородные взаимодействия показаны желтым цветом.

Для глутамина самым благоприятным для образования пи-водородной связи с тирозином и водородной с аргинином оказался не самый представленный ротамер (11/17) с напряженностью 14,58, при наличии клэшей его ориентация и расстояние в среднем благоприятны для образования всех ожидаемых взаимодействий. При этом как для глутамина, так и в большей степени для аспарагина все равно наблюдается вакуум.

Для гистидина:

Рис.9 Замена на гистидин, ротамер с напряженностью 18,81, стекинг показан красным цветом, водородное взаимодействие желтым, пи-катионное зеленым.

В этом случае самым благоприятным с точки зрения ожидаемых взаимодействий оказался ротамер с представленностью 3/6 и напряженностью 18,81, он способен образовывать т-стекинг с кольцом тирозина, быть акцептором для аргинина (правда, расстояние немного большевато) и даже донировать водород на пи-систему (тоже небольшие проблемы с расстоянием), также вероятно пи-катионное взаимодействие гистидина с аргинином.

Рассмотрим вероятность замены на тирозин:

Рис.10 Замена на тирозин, ротамер с напряженностью 28,15, стекинг показан красным цветом, пи-водородное взаимодействие желтым, пи-катионное зеленым.

В этом случае самым вероятным мне показался ротамер с представленностью 4/4, однако с самой маленькой напряженностью, он в теории способен также образовывать пи-катионное взаимодействие с аргинином, т-стекинг с тирозином и (не самое вероятное) пи-водородные взаимодействия с этим же тирозином. Как итог можно сказать, что самым вероятным тут видится гистидин, потому что в отличие от аспарагина и глутамина не наблюдается такого большого пустого пространства, в отличие от тирозина больше потенциальных взаимодействий и меньше стерических затруднений, тут можно еще учесть, что остатки, напротив выбранных ротамеров и окаймляющие это пустое пространоство, являются гидрофобными (отсюда понятно отсутствие там воды), а кислород тирозина не очень вписывается в их окружение, так как смотрит прямо на них. По моему мнению, здесь был остаток гистидина.

Задание 1. PoseView

В данном задании предлагалось использовать программу PoseView, чтобы сгенерировать 2D диаграмму взаимодействий для структуры из первого практикума, а именно, 5RER, которая представляет комплекс лиганда с ковидной протеазой. На выходе программы получилась следующая картинка:

На рис.11 мы видим, что программа показала наличие водородных взаимодействий только с одним аминокислотным остатком, да еще и не с тем, с которыми когда-то их выделила я. Разберем выделенные мной тогда взаимодействия:

Рис.12 Предполагаемые галоген-водородные взаимодействия с остатками аргинина и глутамина.

На рис.12 при восстановлении водородов с помощью Pymol, что для остова делается однозначно, мы видим, что донор водородной связи смотрит вообще не в сторону акцептора, поэтому сейчас я бы эту пару как кандидатов на взаимодействие не выбрала.

В случае с гистидином можно сказать то же самое, так как атом азота боковой группы гистидина для взаимодействия с атомом кислорода лиганда должен быть донором водорода, который находится в плоскости кольца, геометрия этого взаимодействия кажется слишком неблагоприятной. Для остовного азота серина наблюдается та же картина, однако в случае цистеина 145 на мой взгляд геометрия достаточно убедительная, но это уже вопрос обговоренных порогов по углу и расстоянию для водородной связи:

Рис.13 Предполагаемые водородные взаимодействия с остатком гистидина (картинка сверху) и остовами серина и цистеина (картинка снизу).

В случае найденного программой взаимодействия с остовом глицина 143 не совсем понятно почему программа выявила его, пропустив в таком случае уже упомянутый цистеин, так как расстояние от донора до акцептора здесь немногим меньше, а угол даже хуже:

Рис.14 Предполагаемые водородные взаимодействия с остатком глицина, найденные программой.

Наконец, касательно гидрофобных взаимодействий и я, и программа на мой нынешний взгляд выявили не всех кандидатов:

Рис.15 Предполагаемые гидрофобные взаимодействия как на мой взгляд сейчас, вишневым выделен метионин 49, найденный также программой.

Программа относительно гидрофобики показала только один остаток метионина, в то время на мой взгляд здесь могут принимать участие следующие группы: радикалы метионинов, -CH2- группы глутамина, аспарагина, гистидина и цистеина.