Практикум 14. Сборка de novo.

В практикуме была создана и проанализирована сборка чтений по проекту ILLUMINA-секвенирования SRR4240359 бактерии Buchnera aphidicola.

Подготовка чтений

Был создан файл с адаптерами секвенирования ILLUMINA на основе доступных адаптеров на сервере. Команда:

$ cat /P/y18/term3/block3/adapters/* > adapters.fa

На странице проекта секвенирования ILLUMINA был скачан fastq-файл по протоколу FTP. Затем программой trimmomatic были удалены возможные остатки адаптеров:

$ java -jar trimmomatic-0.30.jar SE -phred33 SRR4240359.fastq SRR4240359_trimmed.fastq ILLUMINACLIP:adapters.fa:2:7:7
TrimmomaticSE: Started with arguments: -phred33 SRR4240359.fastq SRR4240359_trimmed.fastq ILLUMINACLIP:adapters.fa:2:7:7
Using PrefixPair: 'AGATGTGTATAAGAGACAG' and 'AGATGTGTATAAGAGACAG'
Using PrefixPair: 'TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT' and 'GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT'
Using Long Clipping Sequence: 'GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG'
Using Long Clipping Sequence: 'TTTTTTTTTTAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC'
Using Long Clipping Sequence: 'TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG'
Using Long Clipping Sequence: 'TTTTTTTTTTCAAGCAGAAGACGGCATACGA'
Using Long Clipping Sequence: 'CTGTCTCTTATACACATCTGACGCTGCCGACGA'
Using Long Clipping Sequence: 'AGATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG'
Using Long Clipping Sequence: 'AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC'
Using Long Clipping Sequence: 'TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT'
Using Long Clipping Sequence: 'GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT'
Using Long Clipping Sequence: 'AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTA'
Using Long Clipping Sequence: 'AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT'
Using Long Clipping Sequence: 'AGATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG'
Skipping duplicate Clipping Sequence: 'AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC'
Using Long Clipping Sequence: 'AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT'
Using Long Clipping Sequence: 'AGATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAGACCGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG'
Using Long Clipping Sequence: 'CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT'
Skipping duplicate Clipping Sequence: 'AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTA'
Using Long Clipping Sequence: 'CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGAC'
Using Long Clipping Sequence: 'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT'
ILLUMINACLIP: Using 2 prefix pairs, 17 forward/reverse sequences, 0 forward only sequences, 0 reverse only sequences
Input Reads: 13557938 Surviving: 13502066 (99,59%) Dropped: 55872 (0,41%)
TrimmomaticSE: Completed successfully

0.41% от числа всех ридов являлись предположительными адаптерами. Затем были удалены плохие буквы с концов чтений и оставлены чтения длиной не менее 32.

$ java -jar trimmomatic-0.30.jar SE -phred33 SRR4240359_trimmed.fastq SRR4240359_trimmed.fastq TRAILING:20 MINLEN:32
TrimmomaticSE: Started with arguments: -phred33 SRR4240359_trimmed.fastq SRR4240359_trimmed_2.fastq TRAILING:20 MINLEN:32
Input Reads: 13502066 Surviving: 12184080 (90,24%) Dropped: 1317986 (9,76%)
TrimmomaticSE: Completed successfully

До триммирования размер fastq-файла с чтениями составлял 1375 Mb, а после 1223 Mb . Число чтений изменилось с 13557938 до 12184080, то есть осталось 89.87% от числа всех чтений.

Формирование сборки

Запуск программы velveth:

$ velveth Velveth_out 31 -fastq SRR4240359_trimmed_2.fastq -short
[0.000000] Reading FastQ file SRR4240359_trimmed_2.fastq
[28.622518] 12184080 reads found.
[28.622555] Done
[28.650216] Reading read set file Velveth_out/Sequences;
[31.591929] 12184080 sequences found
[45.959234] Done
[45.959301] 12184080 sequences in total.
[45.959457] Writing into roadmap file Velveth_out/Roadmaps...
[51.465125] Inputting sequences...
[51.467065] Inputting sequence 0 / 12184080
[54.279750] Inputting sequence 8000000 / 12184080
[54.522769] Inputting sequence 5000000 / 12184080
[54.819581] Inputting sequence 11000000 / 12184080
[55.147434] Inputting sequence 2000000 / 12184080
[59.244417] Inputting sequence 10000000 / 12184080
[59.476300] Inputting sequence 1000000 / 12184080
[60.090676] Inputting sequence 7000000 / 12184080
[60.292300] Inputting sequence 4000000 / 12184080
[64.781069] Inputting sequence 9000000 / 12184080
[64.807550] Inputting sequence 12000000 / 12184080
[65.345487] Inputting sequence 3000000 / 12184080
[65.879250] Inputting sequence 6000000 / 12184080
[66.802754]  === Sequences loaded in 16.074920 s
[66.804462] Done inputting sequences
[66.804497] Destroying splay table
[66.966899] Splay table destroyed

Запуск программы velvetg:

$ velvetg Velveth_out/

. . . . .

Final graph has 694 nodes and n50 of 70607, max 125674, total 682206, using 0/12184080 reads

N50 оказалось равным 70607. Также был получен файл с основной информацией о контигах. Данные о 3 самых длинных контигах приведены в таблице 1.

Таблица 1

ID контига	Длина	Покрытие	Fasta-файл
12	125674	44.550949	fasta
1	108447	42.009184	fasta
14	71403	39.411551	fasta

Анализ сборки

3 самых длинных контига были выровнены megablast с хромосомой бактерии Buchnera aphidicola (AC - CP009253). Число гэпов и однонуклеотидных различий есть в результатах выравниваний контигов с хромосомой: контиг 12, контиг 1, контиг 14. На рисунках 1, 2, 3 приведены карты локального сходства.

Контиги ложились более-менее равномерно, визуальный разрыв 12 контига на карте локального сходства объясняется тем, что хромосома кольцевая. В целом можно сказать, что штамм из проекта секвенирования имел множественные индели, так как на рисунках 1-3 карты локального сходства не показывают непрерывного выравнивания контигов с хромосомой, насколько об этом позволяет утверждать информация о трёх самых длинных контигах. Для более точной информации следует анализировать остальные контиги.