Для выполнения задания использовалась ДНК бактерии Bacillus subtilis str.168, а также участки
связывания ТФ MurR.
С помощью сервиса MEME были найдены мотивы связывания (все параметры, за исключением E-value = 5, были оставлены неизменными).
Результаты поиска можно видеть в таблице1.
Таблица 1. Находки сервиса MEME
| Мотив | E-value | PWM | Лого |
| TGAAATTWTATTTCAS | 2.8e-003 | PWM | |
Далее с помощью сервиса TOMTOM в базе данных RegTransBase были найдены мотивы, схожие с тем, что получил MEME. Сведения о находке можно видеть в таблице 2.
Таблица 2. Находки сервиса TOMTOM
| Название | E-value | PWM | Выравнивание |
| Atu4556_Rhizobiales | 2.10e+00 | PWM-tomtom |  |
Из выравнивания видно, что найденный мотив мало схож с исходным: он длиннее, а также имеет ряд отличий по нескольким позициям. Разница также подтверждается достаточно большим E-value.
С помощью программы FIMO в геноме бактерии были найдены схожие мотивы связывания и их координаты относительно upstream regions.
Поиск проводился в области upstream в связи с тем, что ТФ связывается с ДНК в участке, который находится перед регулируемым геном.
Полный список находок можно посмотреть здесь. Т.к. большинство находок обладают достаточно большим q-value, было решено рассматривать
последовательности, приведенные в таблице 3.
Таблица 1. Достоверные находки сервиса FIMO
| Название последовательности | Цепь | Начало | Конец | p-value | q-value | Найденная последовательность |
|---|---|---|---|---|---|---|
| NP_388051.1|murQ | - | 7 | 22 | 5.13e-09 | 0.0136 | TGAAATTTTATTTCAC |
| NP_391080.2|dhbA | + | 39 | 54 | 1.55e-07 | 0.206 | TGAAATTATATTTGAC |
Командой featcopy были извлечены координаты соответствующих генов и по ним определены абсолютные координаты связывания ТФ: (193053..193067)и (3292436..3292451) complement.
Поиск данных белков по базе данных STRING показал, отсутствие метаблической связи между ними. Ген murQ кодирует белок N-ацетилмурамовую 6-фосфатэтеразу. Конкретно катализирует расщепление заместителя D-лактилового эфира MurNAc 6 -фосфата, получая GlcNAc 6 -фосфат и D-лактат. Ген dhbA кодирует белок 2,3-дигидроксибензоат-2,3-дегидрогеназу из класса оксиредуктаз.
С помощью базы данных REBASE, которая содержит информацию о бактериальных ДНК метилтрансферазах и их сайтах узнавания, а также
предсказанных ранее мотивов,
необходимо было проверить, может ли метилирование повлиять на связывание транскрипционного фактора MurR со своим сайтом.
Метилирование ДНК — это модификация молекулы ДНК без изменения самой нуклеотидной последовательности ДНК, что можно рассматривать как часть эпигенетической
составляющей генома.
Метилирование ДНК заключается в присоединении метильной группы к цитозину в составе CpG-динуклеотида в позиции С5 цитозинового кольца.
Метилирование ДНК считается, в основном, присущим
эукариотам. У человека метилировано около 1 % геномной ДНК.
Программа fuzznuc пакета EMBOSS предназначена для поиска паттернов в заданной последовательности. Эта программа использовалась для поиска сайтов метилирования,
пересекающихся с двумя
находками программы FIMO (были взяты сами мотивы и участки ± 30 нуклеотидов по бокам от них).
Т.к. один из мотивов лежал на обратной цепи, последовательность, извлеченная из NCBI в
fasta-формате, предварительно была обработана скриптом seq.py, содержащим команды
модуля BioPython и переводящий последовательность в комплементарную ей(соответствующую обратной цепи).
В участках искались сайты из файла sites.pat, содержащего сайты
метилирования:
Команда: fuzznuc -sequence len_1.fa -pattern @sites.pat -outfile fuzz_out_1.out
Итоговые файлы: fuzz_out_1.out fuzz_out_2.out
Численное описание результатов можно увидеть в Таблице n.
| Название гена/локуса | Исходные координаты мотива | Число найденных совпадений | Файл с мотивом | Файл с результатом |
|---|---|---|---|---|
| murQ | 193053..193067(+) | 32 | len_1.fa | fuzz_out_1.out |
| dhbA | 3292436..3292451(-) | 24 | len_2_final.fa | fuzz_out_2.out |
Таблица n. Найденные программой fuzznuc сайты метилирования в участках генома Bacillus subtilis str. 168
В файлах с результатами оказалось много найденных "пересечений", состоящих из 1-3 нуклеотидов, которые были удалены из итогового файла. Итоговые результаты для первого мотива
и для второго
мотива.
Таким образом осталось 32 находки в первом случае и 24 во втором. Однако такое количество находок сомнительно, так как большинство сайтов представляют собой последовательности из
нуклеотидов,
записанных с помощью ambiquity code. Из-за этого число находок завышено. Более того, большинство сайтов маленькой длины, что, опять же, обеспечивает много незначимых находок.
В БД REBASE был найден геном нашей бактерии и закодированные в нем метилтрансферазы. Для всех в БД указана специфичность, но ни один сайт не был найден в
наших участках,
так что можно предположить, что связывание ТФ со своими сайтами никак не регулируется их метилированием.
Источники:
© Avdiunina Polina, 2017