A-, B-, Z- формы ДНК

A-, B- и Z- формы ДНК

С помощью пакета 3DNA были построены A, B и Z формы ДНК. A и B состоят из GATC повторов, Z - только из GC пар. Использованная команда: fiber -(a,b,z) filename.pdb

На рисунках 1, 2 и 3 показаны формы ДНК, построенные программой. Скачать полученные pdb файлы можно по ссылкам :

Рис. 1. А форма ДНК. Изображения в профиль и с торца. Покраска color group в Jmol.

Рис. 2. B форма ДНК. Изображения в профиль и с торца. Покраска color group в Jmol.

Рис. 3. Z форма ДНК. Изображения в профиль и с торца. Покраска color group в Jmol.

Задание 1: используя pdb файл А формы, выделим сахарофосфатный остов (рис 4), все нуклеотиды (рис. 5), все аденины (рис. 6), атом N7 в первом гуанине (рис.7).

Рис. 4. Сахарофосфатный остов выделен голубым цветом, всё остальное - жёлтым. Команда в Jmol - select backbone

Рис. 5. Выделены цветом все нуклеотиды (то есть вся ДНК, т.к. ДНК состоит из нуклеотидов).

Рис. 6. Жёлтым цветом выделены аденины. Команда в Jmol - select A

Рис. 7. Выделенный жёлтым атом - седьмой азот у первого гуанина. Модель cpk.

Задание 2: было дано 2 PDB файла, в одном из них был комплекс РНК+белок, в другом - ДНК+белок. Скачать данные pdb файлы можно по ссылкам 1PP8 (ДНК+белок), 1GTS (РНК+белок). На рисунках 8 и 9 представлены изображения данных комплексов.

Рис. 8. 1GTS - комплекс ДНК+белок.Малиновым выделена нуклеиновая кислота, субъединицы белка - радужная раскраска.

Рис. 9. 1PP8 - комплекс РНК+белок.Малиновым выделена нуклеиновая кислота, субъединицы белка - радужная раскраска.

Далее было необходимо проверить структуры нуклеиновых кислот на наличие разрывов. В данной РНК разрывов найдено не было. В ДНК же ситуация обратная, разрывов много. Это могло произойти по причине недостаточного разрешения рентгеноструктурного анализа. Это предположение было сделано на основе того, что разрывы расположены симметрично и с определённой периодичностью. Но это также может указывать на то, что механизм работы белка включает в себя разрезание ДНК. Но это вряд ли.

Результаты представлены на рисунках 10 и 11.

Рис. 10. Структура ДНК из данного файла. Разрывы обведены в белые овалы.

Рис. 11. РНК, видимых разрывов нет. Голубым цветом показан АМФ.

В задании 3 было необходимо найти большие и малые бороздки в разных формах ДНК. Начнём с наиболее распространённой формы - B-формы. На рисунке 12 белой и розовой линией показаны большая и малая бороздки соответственно. В В-форме их размер соответствует названиям, однако в других формах большая бороздка не всегда больше малой. Главное отличие двух бороздок друг от друга в глубине: большая бороздка всегда глубже малой. Определение бороздок важно, так как многие ферменты взаимодействуют именно с большой бороздкой ДНК, потому что нуклеотиды в ней лежат более открыто.

Рис. 12. B-спираль ДНК с обозначенными большой (белая линия) и малой (розовая линия) бороздками.

Атомы оснований, которые составляют ДНК, можно экспонировать в большую или малую бороздки. Проделаем это для тимина. Рисунок 13, полученный с помощью ChemSketch, отражает положение атомов относительно бороздок (красным цветом показаны атомы, обращённые в большую бороздку; синим - в малую).

В сторону малой бороздки обращены N1, C2, O2.
В сторону большой бороздки обращены С4, С5, С6, С5М, О4
Остальные атомы - N3

Теперь перейдём к рассмотрению и других форм ДНК. В таблице 1 представлены характеристики всех трёх форм, все данные были получены с помощью Jmol, процесс измерения показан на рисунке 14.

Таблица 1. Сравнение характеристик 3х наиболее распространённых форм ДНК

	A-форма	B-форма	*Z-форма
Тип спирали (правая или левая)	Правая	Правая	Левая
Шаг спирали (нм)	2.803 (от P1)	3.091 (от P1)	4.35 (от P1)
Число оснований на виток	12	10	13
Ширина большой бороздки (нм)	0.798	1.791	0.72
Ширина малой бороздки (нм)	1.697	1.169	1.517

Рис. 14. Измерения шага спирали и длины бороздок для всех трёх форм ДНК.

Теперь измерим торсионные углы для Т11. Это возможно сделать с помощью средств Jmol. В нуклеиновых кислотах обычно измеряют 7 таких углов, для их измерения необходимо 4 атома. Таблица, в которой показано, между какими атомами мы будем измерять торсионные углы, приведена ниже (составлено не мной):

      alpha:   O3'(i-1)-P-O5'-C5'
      beta:    P-O5'-C5'-C4'
      gamma:   O5'-C5'-C4'-C3'
      delta:   C5'-C4'-C3'-O3'
      epsilon: C4'-C3'-O3'-P(i+1)
      zeta:    C3'-O3'-P(i+1)-O5'(i+1)

      chi for pyrimidines(Y): O4'-C1'-N1-C2
          chi for purines(R): O4'-C1'-N9-C4>

Процесс измерения для А-формы показан на рисунке 15, а в таблице 2 приведено сравнение полученных значений торсионных углов для А и В формы со значениями, которые были в презентации.

Рис. 15. Измерение торсионных углов для А формы ДНК.

Таблица 2. Полученные торсионные углы для А и В формы ДНК и их сравнение со значениями из презентаций.

	α	β	γ	δ	ε	ζ	χ
A-ДНК (измеренное)	-51.7	174.8	41.7	79.1	-147.8	-75.1	-157.2
А-ДНК (презентация)	62	173	52	88	178	-50	-160
B-ДНК (измеренное)	-29,9	136,4	31.1	143.4	-140.8	-160.5	-98
B-ДНК (презентация)	61	171	54	123	155	-90	-117

Как видно, значения торсионных углов, измеренные вручную и из презентации различаются довольно сильно. Возможно, это произошло потому, что измерения вручную проводились только для тимина, а в презентации были представлены некие обощённые данные (средние значения) для всех нуклеотидов и для природных молекул ДНК.

Теперь сделаем расчёт торсионных углов при помощи программы 3DNA. Сначала переведём наши pdb файлы в старый pdb формат, так как программа работает только с ним. Сделать это можно при помощи программы remediator --old 'XXXX.pdb' > 'XXXX_old.pdb'.

С помощью программ find_pair и analyze получим данные для торсионных углов: составляем из них конвеер find_pair -t gatc_x.pdb stdout | analyze. На выходе получаем множество файлов, нас интересует файл с расширением .out. Открыв его, мы увидим много различных таблиц по различным характеристикам ДНК, нас интересует таблица с торсионными углами. Проделываем это для всех трёх форм ДНК. Значения измеренных торсионных углов для А и В форм совпали с теми, что выдала программа. Для Z формы было обнаружено, что торсионные углы при цитозине и гуанине сильно отличаются друг от друга (это продемонстрировано на рисунке 16).

Рис. 16. Измерение торсионных углов для Z формы ДНК с помощью программы 3DNA.

Проанализируем торсионные углы в тРНК из 1GTS.pdb. С помощью Excel были посчитаны средние значения для торсионных углов. Результаты представлены в таблице 3. В сравнении с ДНК, углы тРНК больше похожи на углы А-формы, чем на углы В-формы. Углы для некоторых нуклеотидов сильно отклоняются от средних значений. Это происходит либо в том месте, где вторичная структура формирует изгиб, либо у тех нуклеотидов, которые не могут образовать классическую уотсон-криковскую пару с соседним нуклеотидом (например, один урацил с нестандартными углами лежал напротив другого урацила). Также экстремальные значения торсионных углов могут быть связаны с ошибками при расшифровке структуры.

Таблица 3. Средние значения торсионных углов в тРНК из 1GTS.

	α	β	γ	δ	ε	ζ	χ
Т-РНК	-28,24	57,02	59,18	87,07	-125,9	-79,97	-133,09
Отклоняющийся нуклеотид (G4)	171,8	-172,1	172,4	81,2	-131,2	-73,7	-176,5

Теперь проанализируем схожим образом торсионные углы в ДНК из 1PP8.pdb. По измеренным средним значениям сложно судить о том, в какой форме находится ДНК. Результаты в таблице 4.

	α	β	γ	δ	ε	ζ	χ
ДНК из 1PP8.pdb	-54,9	30,45	34,70	135,53	-141,44	-100,24	-123,78
Отклоняющийся нуклеотид (A46)	-179,7	154,9	158,3	138,5	-150,5	-97,1	-145,4

Проанализируем вторичную структуру РНК из файла 1GTS.pdb. Известно, что у РНК намного больше разнообразных элементов во вторичной структуре, и она устроена сложнее, чем у ДНК. Выделяют стебли, узлы, псевдоузлы, выпетливания, шпильки и т.д. РНК бывают различных видов и выполняют в клетке большой спектр функций. В нашем случае работа будет проводиться на тРНК. В структуре тРНК выделяют 3 петли (Т-петля, Д-петля и антикодоновая петля), акцепторный стебель. Если нарисовать тРНК схематично, то получится нечто, похожее на клеверный лист.

Для определения стеблей вручную вернёмся к файлу 1GTS.out. Искать будем 4 стебля. Результат представлен на рисунке 17.

Рис. 16. Выделение 4х стеблей в данной тРНК. Красный - акцепторный стебель, голубой - антикодоновый стебель, зелёный - Т-стебель, розовый - Д-стебель.

Рис. 17. Структура данной последовательности тРНК, построенная с помощью Kinefold.

Однако в РНК возможны не только канонические взаимодействия нуклеотидов, но и неканонические. По рисункам 16 и 17 можно понять, что это U55:G18, U38:U32, C44:a26, A13:A45. Итого 4 неканонические пары.

Теперь перейдём к рассмотрению стэкинг-взаимодействий. Стэкинг - это явление взаимодействия ароматических колец между собой, которое повышает общую устойчивость соединения. В нуклеиновых кислотах стэкинг параллельный: ароматические кольца нуклеотидов находятся строго друг под другом. На рисунке 18 представлены все стэкинг взаимодействия между основаниями в РНК из 1GTS.pdb. В розовый прямоугольник взяты нуклеотиды, дающие наибольшую площадь перекрывания. В голубых прямоугольниках - пары с наименьшей площадью перекрывания. Как видно, у двух пар вообще нет перекрывания, значит между ними никакого стэкинга не возникает.

Рис. 18. Информация о площади перекрывания, полученная из файла 1GTS.out.

С помощью команд " ex_str -N stacking.pdb stepN.pdb" и "stack2img -cdolt stepN.pdb stepN.ps" были получены изображения пар нуклеотидов с наибольшим и наименьшим перекрыванием. Эти же пары обведены на рисунке 18 в рамочки. На рисунке 19 изображены 3 пары с наименьшей площадбю перекрывания, на рисунке 20 - пары с наибольшим перекрыванием.

Рис. 19. Пары с наименьшей площадью перекрывания

Рис. 20. Пары с наибольшей площадью перекрывания