Standalone BLAST

Поиск некодирующих РНК, аннотированных в одном штамме, в геноме другого штамма

Скачаем с FTP сервера NCBI файл, который содержит все РНК из организма Bacillus subtilis штамма 168 uid57675. Типы РНК, содержащиеся в файле - транспортная РНК, рибосомальная РНК, так называемая miscellaneous_RNA (misc_RNA) - это некодирующие РНК (т.е. РНК, которые не транслируются в белки). Всего в данном файле содержится 63 последовательности misc_RNA.

Сначала с помощью команды grep отберём только информацию о misc_RNA. Команда: "infoseq "NC_000964.frn" | grep "misc_RNA" > misc_RNA.fa". В полученном файле вручную удалим все столбцы, кроме первого (список USA). Чтобы получить список всех misc_RNA вместе с их последовательностью, применим следующую команду: "seqret @USA.fa misc_RNA_seq.fa".

Файлы, полученные в процессе работы:

1. Файл, содержащий информацию только о misc_RNA - скачать
2. Файл, содержащий список USA misc_RNA - скачать
3. Файл, содержащий последовательности misc_RNA - скачать

Далее было необходимо скачать аналогичные файлы для организма Bacillus subtilis spizizenii TU B 10 uid73967, с расширением .gbk, с расширением .fna.

По .fna файлу для нового штамма составим базу данных с помощью программы: "makeblastdb -in NC_016047.fna -dbtype nucl" (программа взята из подсказок лдля Standalone BLAST). В результате работы этой программы были получены файл 1, файл 2, файл 3, в них и содержится база данных.

Теперь запустим blastn, чтобы получить нужные нам выравнивания. Программа выглядит так: "blastn -task blastn -query misc_RNA_seq.fa -db NC_016047.fna -outfmt 7 -num_alignments 1 -out alignment.fa" (программа взята из тех же подсказок). Получился файл c выравниваниями последовательностей misc_RNA из первого штамма Bacillus subtilis с последовательностями их гомологов из второго штамма той же бактерии.

В результате была получена таблица Excel, где суммированы данные о выравнивании, гомологе и изначальной полседовательности. Её можно скачать здесь (лист 1) или посмотреть на рисунке 1.

Рис.1. Итоговая таблица Excel по всем misc_RNA Bacillus subtilis

Поиск гомологов РНК Bacillus subtilis в геноме другой бактерии

С того же FTP сервера NCBI был скачан геном бактерии Bacillus cereus FRI 35 uid173403. Его будем использовать как базу данных (по аналогии со вторым штаммом в первом задании). Проведём поиск гомологов тремя способами:

1. Megablast с теми же параметрами, что и в первом задании: "blastn -task megablast -query misc_RNA_seq.fa -db NC_018491.fna -outfmt 7 -num_alignments 1 -evalue 0.001 -out megablast2.fa". Получившийся файл можно скачать здесь
2. Blastn со стандартными параметрами: "blastn -task blastn -query misc_RNA_seq.fa -db NC_018491.fna -evalue 0.001 -outfmt 7 -out blastnstandart.fa". Полученный файл.
3. Blastn c изменёнными параметрами: "blastn -task blastn -query misc_RNA_seq.fa -db NC_018491.fna -evalue 0.001 -outfmt 7 -out blastnexotic.fa -word_size 4 -penalty -1 -reward 1". Полученный файл.

По данным этих выравниваний была составлена таблица Excel (лист 2), в которой подсчитано количество найденных гомологов с e-value <0,001. Увидеть её можно на рисунке 2.

Рис.2. Cравнение результатов выравнивания, полученных с помощью различных алгоритмов.

Очевидно, что megablast ищет самые близкие (а потому похожие) гомологи исходного гена, поэтому находок так мало, но зато мы более или менее уверены в их достоверности. Blastn со стандартными параметрами находит меньше, чем Blastn с изменёнными. Две эти программы могут обнаружить более отдалённый гомолог заданной последовательности, который по критериям megablast не подойдёт. Как видно из заданий 1 и 2, megablast удобно применять на очень близких организмах (например, штамм одного и того же вида), так как находок всё равно будет не так много и можно будет утверждать, что они достаточно достоверны. Но на более далёких организмах (например, разные виды одного и того же рода), megablast уже может не подойти для поиска гомологов, и тогда надо будет воспользоваться программами с менее строгими критериями.

Поиск неправильно аннотированных генов программой blastx

Скачиваем с FTP сервера NCBI файл, в котором лежат все белки Bacillus subtilis spizizenii TU B 10 uid73967. Теперь он будет базой для поиска гомологов misc_RNA из первого штамма Bacillus subtilis. Предполагается, что гомологов обнаружиться не должно, поскольку misc_RNA - это РНК, а в качестве базы мы используем нечто белковое.

Команда для создания базы: "makeblastdb -in NC_016047.faa -dbtype prot".

Команда для выравнивания: "blastx -query misc_RNA_seq.fa -db NC_016047.faa -out wrongway.fa -outfmt 7 -evalue 0.0001"

Нашлось несколько белковых "гомологов" к изначальным РНК. Они представлены на рисунке 3.

Рис.3. Найденные белки-"гомологи" изначальных misc_RNA и данные по выравниваниям

Как видно из таблицы, ошибочно были найдены не только гипотетические белки, но и 2 подтверждённых белка - серил-тРНК синтетаза и аспартокиназа. Если запустить blastp для серил-тРНК синтетазы, то будут найдены консервативные домены, а также много гомологов с хорошим сходством и e-value, что может свидетельствовать о достоверности этого варианта аннотации. Для аспартокиназы - аннотация точно ошибочная, поскольку под идентификатором Refseq лежит очень короткая последовательность этого белка.