Чтение последовательностей по Сэнгеру

Упражнение 1

Прочитение последовательности ДНК на основании данных, полученных из капиллярного секвенатора по Сэнгеру. Проблемы при чтении хроматограмм

Капиллярный секвенатор выдает файлы с хроматограммой и автоматически прочтённой последовательностью в формате .ab1. В данной работе анализировались два файла, соответствующих прочтению прямой и обратной цепочки ДНК.

Ссылки на исходные файлы .ab1

Прямое прочтение

Обратное прочтение

Таблица 1. Длины нечитаемых участков прямого и обратного прочтений

Прочтение	Координаты 5'- конца	Координаты 3'- конца
Прямое	1-31	690-714
Обратное	1-66	643-724

Хроматорграммы качественные, читаемые. Пики шума, в среднем, имеют малую высоту: 5% от сигнала при прямом и 10% при обратном прочтении. Обратное прочтение сильно зашумлено кравсителем или солями ближе к 600. Последовательности были избавлены от зашумлённых концов. Далее приводится нумерация относительно новых отредактированных последовательностей.

Ссылки на результат - последовательностьи в fasta формате с выделенными строчными буквами проблемными нуклеотидами и полиморфизмами

Прямое прочтение

Обратное прочтение

Таблица 2. Внесённые исправления

Прямое прочтение
На 38 позиции нуклеотид, не распознанный программой, был исправлен на k (то есть G или T), так как на хтоматограмме присутствуют два пика. По обратному прочтению можно восстановить, что в данной позиции находится тимин.	Рисунок 1
Нуклеотид 642 не был прочитан однозначно. В этой позиции читаются два пика гуанина и аденина, поэтому был выбран IUPAC Code r.	Рисунок 2
Нуклеотиды 645 и 648 не были прочитаны однозначно. В этих позицииях читаются по два пика цитозина и тимина, поэтому в обоих случаях был выбран IUPAC Code y. Использовать комплементарную последовательность в данном случае не передставляется возможным, так как она оказывается сильно зашумлена и обрывается рядом с интересующим участком.	Рисунок 3
Скорее всего,этот участок стоит рассматривать целиком. При движении по хроматоргамме видно, что некоторые группы пиков повторяются, что может быть вызвано ошибкой полимеразы на ранних раундах ПЦР.	Рисунок 4
Обратное прочтение
Для обратной последовательности на цитозин был исправлен 26 нуклеотид, а 36 на тимин.	Рисунок 5
55 нуклеотид не был исправлен, но пик имеет изгиб с правой стороны, что может говорить о незначительном присутствии побочной ДНК, солей, о неровномерном движении в капиляре.	Рисунок 6
178 позиция, возможно, является полиморфизмом при обратном прочтении, однако при прямом однозначно определён аденин.	Рисунок 7

Упражнение 2.

Примеры нечитаемых фрагментов хроматограммы

На хроматограмме есть несколько мест, загрязнённых солями или красителем, однако с них, с использованием обратного прочтения, чаще всего, удаётся прочесть последовательность (Рисунок 8, 9).

Рисунок 8
Рисунок 9

Однако на хроматограмме встречаются участки, расшифровать которые оказывается трудно. Рисунок 10 иллюстрирует пример такого участка. Вероятно, в ходе эксперимента в капиляре вместе с последовательностями ДНК разогнался флуорофор. Из рисунка 11 видно, что на последовательнось, сигнал от кторой. действительно, продолжает приниматься, наслаивается сигнал флуорофоров тимина, аденина и гуанина.

Рисунок 10
Рисунок 11

На основании проведённого анализа, была построена консенсусная последовательность.

IUPAC Code

Ссылка на проект Jalview

Прямое прочтение. Последовательность в Chromas

Обратное прочтение. Последовательность в Chromas