Ресеквенирование. Поиск полиморфизмов у человека.

Задание 1.

Для данной работы мне была дана 22-я хромосома человека (последовательность хромосомы в fasta-формате; файл с одноконцевыми чтениями формата fastq).
Запустив команду fastqc chr22.fastq я получил архив и файл в html-формате, визуализирующий информацию о чтениях.
 

Общая информация о чтениях
 

Визуализация информации о чтениях
 
Как видно, конец ридов прочитан хуже основной части. Это может быть связано с тем, что при увеличении количества итераций идёт накопление ошибок.
 

Задание 2.

Теперь было необходимо произвести очистку чтений с помощью программы Trimmomatic. Командой java -jar /usr/share/java/trimmomatic.jar SE -phred33 chr22.fastq out.fastq TRAILING:20 MINLEN:50 отрезал с конца каждого чтения нуклеотиды качеством ниже 20, оставив чтения длиной не менее 50 нуклеотидов. Результат - файл out.fastq
 

Очистка программой Trimmomatic
 
Программа Trimmomatic удалила 336 (2,94%) чтений.
Затем я вновь запустил FastQC.
 

FastQC после очистки
 
Результат - архив out_fastqc.zip и html-файл с визуализацией информации о чтениях.
 

Визуализация информации о чтениях после очистки
 
Видно, что исчезли риды, у которых на концах были нуклеотиды плохого качества. Лишь последняя позиция расположена в жёлтой области.
 

Базовая информация о чтениях (после очистки)
 
Как видно из данного скриншота, программа Trimmomatic оставила лишь те риды, длина которых была не менее 50.
 

Задание 3.

В данном задании было необходимо откартировать уже очищенные чтения с помощью программы BWA. Для этого я сначала проиндексировал референсную последовательность 22-й хромосомы.
 

Программа bwa index
 
Затем мной было построено выравнивание прочтений и референса:
 

Построение выравнивания программой bwa mem
 

Задание 4.

В этом задании надо было проанализировать полученное в прошлом задании выравнивание. Для начала файл с выравниванием был переведён в бинарный формат .bam .
 

 
Затем выравнивание референса и чтений было отсортировано по координате в референсе начала чтения.
 

 
Результат - файл с отсортированными ридами (в бинарном формате .bam).
После этого отсортированный файл был проиндексирован:
 

 
Затем была получена информация о количестве ридов, откартировавшихся на геном.
 

 
Как видно, откартировалось 11090 ридов.
 

Задание 5.

В данном задании было необхлдимо найти SNP и индели для их последующего анализа.
Сперва был создан файл с полиморфизмами (в формате .bcf).
 

 
Затем был создан файл со списком отличий между референсом и чтениями в формате (.vcf).
 

 
Первые же три полиморфизма из файла diff.vcf были мною описаны:
 

 
Качество и покрытие у первых двух полиморфизмов довольно неплохое, а вот у третьего - не очень.

Задание 6.

Затем было необходимо проанализировать полученные snp с помощью программы annovar (индели не анализировались - для этого я их просто удалил), пользуясь базами данных refgene, dbsnp, 1000 genomes, GWAS, Clinvar. Для этого надо было получить из .vcf файла другой файл, с которым будет работать annovar, с помощью скрипта convert2annovar.pl (расположение скрипта на kodomo - /nfs/srv/databases/annovar), после чего аннотировать по базам данных с помощью скрипта annotate_variation.pl (лежит там же).
Правда, скрипты просто так работать не стали, пришлось изменить права (команда chmod agu+xwr convert2annovar.pl, для другого скрипта - аналогично).
 

Конвертация .vcf-файла в .avinput-файл
 

Аннотация SNP из .avinput-файла по БД dbsnp (snp138), аналогичными командами SNP были аннотированы по другим БД
 

Аннотация SNP из .avinput-файла по БД refgene
 

Аннотация SNP из .avinput-файла по БД 1000 genomes
 

Аннотация SNP из .avinput-файла по БД GWAS
 

Аннотация SNP из .avinput-файла по БД Clinvar
 
Из полученных SNP 176 имеют rs, а 38 - не имеют (файлы rs.hg19_snp138_dropped и rs.hg19_snp138_filtered соответственно).
При аннотировании с помощью базы RefGene было найдено 75 het и 139 hom замен. В самой БД refgene snp делятся на несколько категорий:
Refgene выделил 26 exonic, 6 ncRNA_intronic, 1 ncRNA_exonic и 181 intronic полиморфизмов.  
SNP попали в 3 гена:
Стоит отметить, что полиморфизмы, попавшие в ncRNA, входили в состав гена TTC28, и выдаче Refgene отмечались как TTC28-AS1 - то есть, TTC28 antisense RNA 1. Также стоит сказать, что экзоны были затронуты в каждом из генов.
 
Информацию по покрытию и качеству полиморфизмов можно взять в аннотациях по любой БД, но больше всего аннотаций было выдано по БД Refgene, поэтому информацию я брал оттуда. Аннотации с хорошим покрытием также имеюли высокое качество чтений. Аннотаций с покрытием не более 4 было 130 штук, не менее 5 (довольно хорошее) - все остальные (84). 72 аннотации имели покрытие выше 10.
 
Информация по аминокислотным заменам, к которым привели SNP, хранится в файле refgene.exonic_variant_function. Всего замен получилось 126, из них 18 несинонимичных и 8 синонимичных.
 
Информацию о частоте аллели я брал из аннотаций БД 1000genomes (данные нашлись для 140 аннотаций). Довольно много попалось редких полиморфизмов (с частотой от 0,001 до 0,3) - 66 штук, остальные 74 полиморфизма довольно распространены (частота > 0,3).
 
Клиническая аннотация полиморфизмов приведена в БД Gwas. В 22-й хромосоме было найдено 3 полиморфизма по этой БД. Первый полиморфизм - в гене MYO18B, охарактеризован как отвечающий за нарушения математических способностей у детей с дислексией. Второй - в гене TTC28, ожирение. Третий полиморфизм - в гене APOL1, гломерулосклероз.
 
Таблица с выдачей аннотаций по разным БД.
 
 
 
Ссылка на главную страницу

© Головачев Ярослав