Сборка генома de novo

В данном задании выполнялся анализ проекта по секвенированию грамотрицательной бактерии Buchnera aphidicola, полученного в базе данных ENA (European Nucleotide Archive) по коду доступа - SRR4240358. Buchnera aphidicola относится к типу Proteobacteria и является основным симбионтом тлей, располагающимся в бактериосомах, расположенных внутри тли [1].
В базе данных был скачан архив, содержащий проект по секвенированию генома бактерии в формате .fastq, а затем с помощью программы gunzip из пакета EMBOSS он был разархивирован.

Подготовка чтений

Сперва был создан файл adapters.fasta, в котором содержалась информация о последовательностях адаптеров для Illumina. Затем с помощью команды:

java -jar /usr/share/java/trimmomatic.jar SE -phred33 SRR4240358.fastq SRR4240358_cl.fastq ILLUMINACLIP:adapters.fasta:2:7:7

Файл, скачанный из базы данных, был очищен от возможных остатков последовательностей адаптеров, вследствие чего его размер уменьшился с 1125 MB до 1106 MB. После этого, проводилось удаление плохих букв с концов чтений, оставив только чтения длиной не менее 30 п. н. с помощью команды:

java -jar /usr/share/java/trimmomatic.jar SE -phred33 SRR4240358.fastq SRR4240358_cle.fastq TRAILING:20 MINLEN:30

Что привело к сокращению размера файла до 886 MB, за счёт удаления 1862418 ридов, что соответствует 17,66% от всех чтений, 8681421 (82,34%) рид остались.

Подготовка k-меров

Далее с помощью программы velveth, осуществляющей сборку генома на основании графов де Брайна, были составлены k-меры, или слова длины k, из коротких ридов с дальнейшем составлением на их основе графов. Для данного задания бралась величина k-меров, равная 29 и 25 (что соответствует длине перекрытий ридов между собой), и выполнялась команда:

velveth velv 29 -short -fastq SRR4240358_cle.fastq
velveth velveth 25 -short -fastq SRR4240358_cle.fastq

Что привело к созданию двух папок velv и velveth, содержащих 3 файла. Затем с помощью программы velvetg осуществлялась сборка генома на основе созданных k-меров и постройка непосредственно ориентированного графа:

velvetg velv
velvetg velveth

В ранее созданных папках появлялись файлы: contigs.fa, stats.txt и LastGraph, в которых содержалась информация о полученной сборке генома. В Таблице 1 представлена общая информация о сборках при k равном 29 и 25.

Как видно из Таблицы 1 при длине слов равной 29 длина контига, начиная с которого покрывается больше половины генома, или N50, значительно больше оного при длине 25, что также коррелирует с большей максимальной длиной контига для 29. Однако число ридов, использованных для построения генома больше при длине слова 25, чем при длине 29. А также можно заметить большую разницу между количеством контигов, составленных при k равном 29 и 25.

Далее проводился анализ получившихся геномов, анализ для обоих k-меров сведен в Таблицу 2, где приведена информация о контигах с максимальной длиной и их покрытие. Можно заметить чем больше длина контига, тем меньше их покрытие.

Для дальнейшего анализа полученного генома с помощью программы Excel были подсчитаны среднее значение и медиана величин покрытия и длин контигов обоих k-меров, информация об этом собрана в Таблицу 3.

Исходя из данных, приведенных в Таблице 3, можно сделать вывод, что среди найденных контигов довольно много коротких контигов, но так же присутствуют контиги большой длины, однако для k-мера равного 25 таких контигов меньше, а преобладает число коротких, о чем говорит разница в их средних значениях и в медианах, при том, что число контигов для 25 больше. Помимо этого, видно, что медиана и среднее значения для покрытий контигов так же очень сильно отличаются, однако при проведении анализа на наличие контигов со значением отличающимся от среднего в 5 раз больше или меньше, было обнаружено, что для k-мера 29 число контигов со значением меньше в 5 раз от среднего составляет 548, а со значением больше в 5 раз - только один контиг. В Таблице 4 приведена информация об аномальном большом и о трех аномально малых контигах.

Анализ генома

Для дальнейшего анализа полученной сборки проводилось сравнение самых длинных контигов с хромосомой того же организма (CP009253) с помощью программы BLASTN в NCBI megablast. Приведенные выше контиги с наибольшими длинами в Таблице 2 были выровнены относительно известного генома, результат этого анализа приведен в Таблице 4.

Для каждого из контигов было получено несколько находок, из которых выбраны находки с максимальным покрытием в геноме. Ниже на Рис. 1-3 представлены карты локального сходства, построенные программой BLASTN.

Источники: