Прочтение последовательностей по Сэнгеру
Упражнение 1. Получение последовательности фрагмента ДНК, По результатам хроматограмм из капиллярного секвенатора по Сэнгеру и
последовательности, сгенерированной программой.
Ссылки на исходные файлы: прямая цепь,
обратная цепь.
Для просмотра и редактирования будем использовать программу Chromas (Lite).
Результаты: - выравнивание прямой и комплементарной к обратной последовательности с отмеченными измененными
нуклеотидами в проекте JalView;
- файл в формате fasta с "чистой" прочтенной последовательностью.
Порядок выполнения работы:
- открыла файл с прямой последовательностью в Chromos (Lite);
- открыла файл с обратной последовательностью в другом окне и перешла к комплементарной цепочке (опция Reverse+Complement);
- выровняла две хроматограммы с использованием поиска подслов (find);
- затем определила границы нечитаемых 5'- и 3'-участков в каждой последовательности; координаты указываются по прямой последовательности:
- 5' нечитаемый участок на прямой цепи: 1 - 25;
- 3' нечитаемый участок на прямой цепи: 713 -719;
- 5' нечитаемый участок на комплементарной цепи: нуклеотиды не представлены в прямой цепи;
- 3' нечитаемый участок на компементарной цепи: 669 - 689.
Рис.1. Изображение 5' нечитаемого участка прямой цепи (сверху) и соответствующего участка комплементарной к обратной
цепи (снизу).
- удалила нечитаемые 5'- и 3'- концы при помощи опции Continuous edit.
Качество хроматограммы прямой цепи:
- сигнал в среднем превосходит шум в 8 раз;
- средняя сила сигнала и шума вдоль оси X равномерна, за конца хроматограммы (сила сигнала увеличивается);
- сила у разных очевидных сигналов отличается примерно в 3 раза. Самые высокие сигналы у A и G, сигналы Т и С ниже;
- особенности: участок с 53 по 61 нуклеотид представляет собой небольшую "кляксу", возможно, пятно краски. Аналогичный участок есть и на
комплементарной цепи (с 634 по 641) (рис.2);
Рис.2. Пятно на хроматограммах прямой цепи (сверху) и комплементарной цепи (снизу).
- в целом, хроматограмма довольно качественная.
Качество хроматограммы комплементарной цепи:
- сигнал в среднем превосходит шум в 9 раз;
- средняя сила сигнала и шума вдоль оси X равномерна, к концу сила сигнала увеличивается;
- сила у разных очевидных сигналов отличается примерно в 2,5 раза. Самые высокие сигналы у Т и С, сигналы А и G ниже;
- в целом, хроматограмма довольно качественная.
- Редактирование прямой цепи.
Проблема 1. Пятно на участке с 53 по 61 нуклеотид.
Рис.3. Проблемный участок на прямой цепи (сверху) в области 53-61. Комплементарная цепь снизу.
На рисунке видно что в позиции 56 пики накладываются друг на друга. Данный участок был проверен по комплементарной цепи, из которой видно,
что в данном месте нуклеотид G.
Проблема 2. Шум выходит на уровень сигнала.
Рис.4. Проблемный участок в позиции 231 на прямой цепи (сверху). Комплементарная цепь снизу.
В позиции 231 два пика накладываются друг на друга. При проверке по комплементарной цепи видно, что это шум и в данном месте находится Т.
- Редактирование комплементарной цепи.
Проблема 3. Нераспознанный сигнал.
Рис.5. Участок прямой (сверху) и комплементарной (снизу) цепей с нераспознанным сигналом в одинаковой позиции.
В обеих цепях в одинаковой позиции не распознан сигнал. Я решила оставить N.
Проблема 4. Лишний нуклеотид.
Рис.6. Изображение участка комплементарной цепи (снизу) с лишним нуклеотидом. Прямая цепь сверху.
В позиции 623 на комплементарной цепи вклинился лишний нуклеотид С, на прямой цепи он отсутствует. Нуклеотид был удален.
На рис.7 приведено изображение участка с очевидными сигналами.
Рис.7. Участок с очевидными сигналами.
Затем обе последовательности были сохранены в формате fasta. Также было сделано выравнивание в Jalview (рис.8).
Рис.8. Изображение выравнивания в Jalview. Строчными буквами обозначены изменения.
Упражнение 2. Пример нечитаемой хроматограммы.
Для этого упражнения был выбран файл kamp3_18SIII_F_F03_WSBS-Seq-1-08-15.ab1.
На рис.9 преставлен участок хроматограммы, предположительно загрязненной другой ДНК, т.к. пики наслаиваются друг на друга.
Загрязнение могло произойти, если праймер для секвенирования отжегся на два разных участка, либо при ПЦР поднялись два фрагмента из исходной ДНК.
В таком случае последовательность прочесть невозможно.
Рис.9. Изображение нечитаемой хроматограммы.
| 