Обзор протеома Mycobacterium haemophilum

РЕЗЮМЕ

В данной работе с использованием Microsoft Excel 2010 и исходных данных о протеоме Mycobacterium haemophilum DSM 44634 было проведено исследование, в результате которого были построены гистограммы распределения белков по длине, квазиоперонов по числу генов, определена доля гипотетических белков в протеоме, отмечены особенности перекрывания генов.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА

Протеом, распределение белков, квазиопероны, перекрывание генов, Mycobacterium haemophilum DSM 44634.

1   ВВЕДЕНИЕ

Mycobacterium haemophilum – вид патогенных для человека бактерии, вызывающих поражения кожи у лиц с ослабленным иммунитетом. Как и другие представители рода Mycobacterium, данные бактерии являются грамположительными неподвижными аэробными бациллами, проявляющими свойства кислото- и спиртоустойчивости. Характерными особенностями Mycobacterium haemophilum являются необходимые для оптимального роста достаточно низкая температура (30 – 32 °C) и содержание в субстрате соединений железа: гемина либо цитрата железа(III)-аммония (Lindeboom J.A., Bruijnesteijn van Cop-penraet L.E.S., van Soolingen D., Prins J.M., Kuijper E.J., 2011). Как было показано JoAnn M. Tufariello и соавторами (2015), геном Mycobacterium haemophilum представлен 1 кольцевой хромосомой, которая содержит 3,964 гена и состоит из 4,235,765 пар нуклеотидов.

Данная работа имеет целью выявить некоторые протеомные и геномные особенности Mycobacterium haemophilum (штамм DSM 44634), а также проверить следующие гипотезы:

1) распределение генов по прямой и комплементарной цепи носит случайный характер;
2) доля гипотетических белков зависит от рассматриваемого диапазона длин;
3) перекрывание генов не зависит от того, расположены гены на одной цепи или на разных;
4) среди квазиоперонов преобладают короткие (из 2-3 генов).

2   МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исходные данные: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse#!/prokaryotes/
Mycobacterium%20haemophilum%20DSM%2044634
Инструменты: Microsoft Excel 2010.

Исходные данные в формате текстовой таблицы были импортированы в Microsoft Excel при помощи встроенного мастера импорта. Для удобства работы значения в столбце strand были заменены с + и – на +1 и -1 соответственно. Далее строки, содержащие основную и дополнительную информацию о генах, были отделены друг от друга при помощи фильтра (по столбцу #feature) и скопированы на отдельные листы (1 и 2 соответственно). Затем столбец locus_tag на листе 2 был помещён в начало таблицы и использован как ключ, чтобы с помощью функции VLOOKUP сопоставить каждой строке таблицы 1 соответствующую строку таблицы 2.

Для исследования распределения белков по длинам была построена таблица со столбцом чисел от 0 до 1000 с шагом 50, где каждая пара чисел задаёт диапазон длины белка, и столбцом формул COUNTIFS, при помощи которых было подсчитано количество белков в каждом диапазоне, а также с помощью функции COUNTIF – количество белков с длиной больше 1000; по полученным данным была построена гистограмма.

Аналогично были построены гистограммы распределения доли гипотетических белков в различных диапазонах длин, межгенных промежутков по длинам и квазиоперонов по числу генов. Гипотетические белки определялись по значению hypothetical protein в поле name. Межгенные промежутки определялись как расстояния между концом одного гена и началом следующего; перекрывания генов – как промежутки, не превышающие 0; для определения длины квазиоперонов были отмечены гены, длина промежутка после которых превышала 100 (отдельно рассмотрены гены на разных цепях), и подсчитано число генов между ними.

Гены белков определялись по значению protein_coding, гены РНК – по значениям rRNA, tRNA или Rnase_P_RNA, псевдогены – по значению pseudogene в поле class. Вероятность распределения генов по цепям была определена путём генерации 2000 случайных последовательностей длины, равной количеству генов, из 1 и 0, подсчёта количества 1 в каждой из них, вычисления отклонения этого количества от ожидаемого (половина длины) и определения доли последовательностей, в которых отклонение не меньше, чем в распределении генов.

Для выявления рибосомальных белков и РНК, самых длинных, самых коротких белков и белков, отвечающих за устойчивость к медицинским препаратам, были использованы фильтр по значению ribosomal в поле name, сортировка по убыванию/возрастанию значений поля product_length и фильтр по значениям resistance и multidrug в поле name.

3   РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1  Распределение белков по длине

Распределение белков Mycobacterium haemophilum DSM 44634 по длине отражено на гистограмме (рис. 1). По горизонтальной оси расположены категории белков по длине в аминокислотных остатках (а. о.), по вертикальной оси – количество белков, принадлежащих каждой категории; шаг гистограммы был выбран равным 50 а. о.

Как видно по рис. 1, большинство белков протеома имеют длину от 50 до 400 а. о.; медианное значение длины белка при этом составляет 274 а. о. По-видимому, белки длиной 50 – 400 а. о. являются типичными для данной бактерии.

Определённый интерес представляют белки с наибольшим отклонением длины от среднего значения. Оказалось, что, например, 11 самых длинных белков протеома являются поликетидсинтазами. Скорее всего, это явление объясняется тем, что настолько длинные белки нетипичны для данной бактерии, и вероятность того, что среди них будут присутствовать два или более абсолютно различных белков, крайне мала, в то время как взаимно схожие белки с большими значениями длин в отсутствие других оказываются сгруппированы.

3.2  Рибосомальные белки и рРНК

У Mycobacterium haemophilum обнаружены:

1. 21 белок малых субъединиц рибосом: 30S ribosomal protein S1 – 30S ribosomal protein S20, 30S ribosomal protein S30;
2. 31 белок больших субъединиц рибосом: 50S ribosomal protein L1 – 50S ribosomal protein L11, 50S ribosomal protein L13 – 50S ribosomal protein L25, 50S ribosomal protein L27 – 50S ribosomal protein L33, 50S ribosomal protein L35;
3. 3 рРНК: 5S ribosomal RNA, 16S ribosomal RNA, 23S ribosomal RNA.

3.3  Некоторые особенные белки, присутствующие в протеоме

3.3.1 Поликетидсинтазы

Являются самыми длинными белками в протеоме Mycobacterium haemophilum. Поликетидсинтазы – это ферменты, катализирующие синтез поликетидов – поликарбонильных соединений со сложной структурой, многие из которых проявляют свойства токсинов или антибиотиков. В связи со строением поликетидов для их биосинтеза требуются сложные ферменты, что объясняет относительно большие значения длины полипептидной цепи поликетидсинтаз (до 4185 а. о.)

3.3.2 Предшественник микофактоцина

Является самым коротким белком в протеоме данной бактерии (29 а. о.). В процессе посттрансляционной модификации из него образуется микофактоцин – общий для многих представителей рода Mycjbacterium белок, функционирующий как переносчик электронов. Был описан в 2011 году в статье Daniel H. Haft.

3.3.3 Белки, обусловливающие устойчивость к медицинским препаратам

В протеоме Mycobacterium haemophilum были обнаружены белки длиной от 107 до 803 аминокислотных остатков, обеспечивающие устойчивость бактерии к некоторым медицинским препаратам:

1. Multidrug transporter, multidrug ABC transporter permease, multidrug ABC transporter ATP-binding protein, multidrug MFS transporter – обеспечивают устойчивость ко многим препаратам, выводя их из клетки;
2. Camphor resistance protein CrcB – обеспечивает устойчивость к камфоре;
3. Daunorubicin resistance protein DrrC – обеспечивает устойчивость к даунорубицину (антрациклиновому антибиотику);
4. Bleomycin resistance protein – обеспечивает устойчивость к блеомицину (гликопептидному антибиотику).

3.4  Распределение генов по прямой и комплементарной цепям ДНК

Информация о числе генов белков, генов РНК и псевдогенов на каждой из цепочек ДНК представлена в таблице 1.

Таблица 1. Распределение генов белков, генов РНК и псевдогенов по прямой и комплементарной цепям ДНК

	Гены белков	Гены РНК	Псевдогены	Всего
Прямая цепь	1961	26	80	2067
Комплементарная цепь	1767	23	73	1863

Можно заметить, что общее число генов (3930) отличается от полученного JoAnn M. Tufariello в 2015 году; это связано с последующим обновлением базы данных.

Из таблицы ясно, что во всех категориях генов их число на прямой цепи несколько превосходит число на комплементарной цепи. По результатам моделирования вероятность распределения 3930 генов: 2067 на прямой цепи и 1863 на комплементарной цепи оказалась равной 0,0005; это позволяет сделать вывод о том, что гипотеза (1) о случайном распределении ошибочна с высоким уровнем значимости.

3.5  Доля гипотетических белков среди белков различных длин

Ген гипотетического белка – это ген, схожий с геном белка, но доказательств его экспрессии не получено. В протеоме Mycobacterium haemophilum DSM 44634 гипотетическими являются 1345 из 3728 белков, что составляет 36,08 %. На рис. 2 приведена гистограмма, отображающая процент гипотетических белков в различных диапазонах длин. Видно, что среди белков длиной от 300 до 500 а. о. и более доля гипотетических белков составляет немногим более 20 % от общего числа, в то время как среди более коротких белков она тем выше, чем меньше их длина, и достигает 68 % в диапазоне длин менее 100 а. о. Гипотеза (2) оказалась верна.

Предположительные объяснения этого результата:

1) для более короткой кодирующей последовательности с большей вероятностью найдётся кодирующая последовательность гомологичного гипотетического белка у родственного вида, наличие которой подтвердит его существование;
2) возможно, в силу некоторых причин экспериментально подтвердить экспрессию гена короткого белка более затруднительно.

3.6  Распределение межгенных промежутков по длине

На рис. 3 приведена гистограмма распределения промежутков между генами по длине в парах нуклеотидов (п. н.).

Можно видеть, что для генома Mycobacterium haemophilum DSM 44634 наиболее характерны межгенные промежутки длиной менее 30 п. н., и количество промежутков определённой длины тем меньше, чем больше длина. Незначительное число длинных промежутков ожидаемо, поскольку межгенные промежутки не несут в себе информации, а компактный геном, для воспроизведения которого не требуется много ресурсов, определённо выгоден для одноклеточного быстро размножающегося организма.

3.7  Особенности перекрывания генов

При анализе длин перекрываний генов было выяснено, что большинство из них (576 из 688, или 83,7 %) имеют длину менее 10 пар нуклеотидов. Дальнейшее исследование показало, что 61,48 % от всех перекрываний составляют перекрывания по 4 парам нуклеотидов. Было также изучено, каким именно образом перекрываются гены, поскольку они могут находиться как на прямой, так и на комплементарной цепи. Все перекрывания были условно разделены на 4 типа в зависимости от того, на какой цепи расположены первый и второй перекрывающиеся гены. Например, перекрывание типа 1-ый + / 2-ой + по 4 парам нуклеотидов означает, что старт-кодон 2-го гена перекрывается по 1 нуклеотиду с предпоследним кодоном и по 2 нуклеотидам со стоп-кодоном 1-го гена; типа 1-ый + / 2-ой - – что триплет, комплементарный перевёрнутому (записанному от 3’ к 5’-концу) стоп-кодону 2-го гена, перекрывается по 1 нуклеотиду с предпоследним кодоном и по 2 нуклеотидам со стоп-кодоном 1-го гена.

Полученная информация представлена в таблице 2.

Таблица 2. Доля перекрываний по 4 парам нуклеотидов в зависимости от локализации перекрывающихся генов на прямой или комплементарной цепи

Тип перекрывания	Число перекрываний по 4 п. н.	Всего перекрываний	Доля перекрываний по 4 п. н.
1-ый + 2-ой +	196	304	64,47%
1-ый + 2-ой -	51	109	46,79%
1-ый - 2-ой +	0	6	-
1-ый - 2-ой -	176	269	65,43%
Всего:	423	688	61,48%

Из таблицы видно, что гены, находящиеся на одной цепи, часто перекрываются по 4 парам нуклеотидов; гены, перекрывающиеся по типу 1-ый + / 2-ой -, подвержены этому в меньшей степени; по типу 1-ый - / 2-ой + (когда участок, комплементарный перевёрнутому начальному участку 1-го гена, перекрывается с начальным участком 2-го гена) гены перекрываются крайне редко и вообще не перекрываются по 4 парам нуклеотидов. Таким образом, гипотеза (3) опровергнута.

Объяснение данному явлению, скорее всего, заключается в генетическом коде бактерии, а именно в невозможности перекрывания со старт-кодоном триплета, комплементарного перевёрнутому старт-кодону.

3.8  Распределение квазиоперонов по числу входящих в них генов

Было выяснено, что большая часть генов Mycobacterium haemophilum DSM 44634 группируется в квазиоперон как минимум с ещё одним геном. Не входят в квазиопероны 32,7 % генов на прямой цепи и 35,59 % генов на комплементарной цепи. На рис. 4 изображена гистограмма распределения квазиоперонов по числу генов, которые в них входят.

Из рис. 4 можно сделать вывод, что последовательности из 2 идущих друг за другом генов встречаются намного чаще, чем более длинные квазиопероны; гипотеза (4) подтверждена. Также можно заметить небольшое различие в количестве квазиоперонов на разных цепях, но это объясняется общей неравномерностью распределения генов.

4   ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате исследования было выяснено следующее:

1. Наиболее характерная для протеома Mycobacterium haemophilum длина белка – 50 - 400 аминокислотных остатков;
2. Mycobacterium haemophilum имеет 52 рибосомальных белка и 3 рРНК, а также ряд белков, придающих устойчивость к определённым лекарственным средствам;
3. Распределение генов по прямой и комплементарной цепочкам ДНК с высокой вероятностью носит неслучайный характер;
4. Доля гипотетических белков наиболее высока среди белков небольшой длины;
5. Для генома Mycobacterium haemophilum характерны небольшие по длине межгенные промежутки и квазиопероны из 2-3 генов;
6. Особенности перекрывания генов зависят от того, на каких цепочках расположены перекрывающиеся гены.

5   СОПРОВОДИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Основной файл исследования: https://kodomo.fbb.msu.ru/~pork7007/term1/Pokrovskiy_suppl.xlsx
Моделирование распределения генов: https://kodomo.fbb.msu.ru/~pork7007/term1/Pokrovskiy_random_test.xlsx

6   БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю благодарность всем преподавателям ФББ МГУ, участвующим в подготовке и реализации курса биоинформатики.

7   СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Lindeboom JA, Bruijnesteijn van Coppenraet LES, van Soolingen D, Prins JM, Kuijper EJ. 2011. Clinical manifestations, diagnosis, and treatment of Mycobacterium haemophilum infections. Clin Microbiol Rev 24:701–717. doi:10.1128/CMR.00020-11
2. Tufariello JM, et al. 2015. The complete genome sequence of the emerging pathogen Mycobacterium haemophilum explains its unique culture requirements. MBio 6(6):e01313-01315
3. Haft, Daniel H. (2011). "Bioinformatic evidence for a widely distributed, ribosomally produced electron carrier precursor, its maturation proteins, and its nicotinoprotein redox partners". BMC Genomics. 12: 21. doi:10.1186/1471-2164-12-21. PMC 3023750. PMID 21223593

  Материалы: