PubMed — текстовая база данных медицинских и биологических публикаций на английском языке, на основе раздела «биотехнология» Национальной медицинской библиотеки США (NLM). База данных была разработана Национальным центром биотехнологической информации (NCBI). PubMed является бесплатной версией базы данных MEDLINE.
Результаты запросов в PubMed по данному белку Apaf 1:
| Запрос | Запрос как его понял PubMed из Search details | Всего находок | Всего в открытом доступе | Всего обзоров |
| Apaf 1 | ("apoptotic protease-activating factor 1"[MeSH Terms] OR "apoptotic protease-activating factor 1"[All Fields] OR "apaf 1"[All Fields]) | 1236 | 581 | 169 |
| (Apaf 1[Title]) | Apaf 1[Title] | 250 | 138 | 11 |
| ((Apaf 1[Title]) AND apoptosis [Title/Abstract]) | (Apaf 1[Title] AND apoptosis [Title/Abstract]) | 195 | 111 | 9 |
| ((Apaf 1[Title]) AND apoptosis [Title/Abstract]) AND ("caspase"[All Fields]) | (Apaf 1[Title] AND apoptosis [Title/Abstract]) AND "caspase"[All Fields] | 154 | 95 | 6 |
| ((Apaf 1[Title]) AND apoptosis [Title/Abstract]) AND ("caspase"[All Fields]) AND ("mitochondria"[All Fields]) AND ("cytochrome c"[All Fields]) | (Apaf 1[Title] AND apoptosis [Title/Abstract]) AND "caspase"[All Fields] AND "mitochondria"[All Fields] AND "cytochrome c"[All Fields] | 50 | 33 | 4 |
| ((Apaf 1[Title]) AND apoptosis [Title/Abstract]) AND ("caspase"[All Fields]) AND ("mitochondria"[All Fields]) AND ("cytochrome c"[All Fields]) AND ("1998"[Date - Publication] : "2003"[Date - Publication]) | (Apaf 1[Title] AND apoptosis [Title/Abstract]) AND "caspase"[All Fields] AND "mitochondria"[All Fields] AND "cytochrome c"[All Fields] AND ("1998"[PDAT] : "2003"[PDAT]) | 23 | 16 | 2 |
Ссылка на коллекцию публикаций в PubMed, описывающих исследуемый белок: Collections
Apaf-1, a human protein homologous to C. elegans CED-4, participates in cytochrome c-dependent activation of caspase-3.
Zou H, Henzel WJ, Liu X, Lutschg A, Wang X.
Введение
В 1990 году появилась первая статься по теме исследования механизмов регуляции апоптоза у нематоды C. elegans. Были найдены два гена, ced-3 и ced-4, играющие ключевую роль в процессе самого апоптоза, а также ген ced-9, вышележащий по отношению к двум предыдущим (upstream), функционирующий как отрицательный регулятор транскрипции ced-3 и ced-4.
Программа апоптоза, освещенная у C. elegans, схожа с таковой у млекопитающих, которые имеют гомологи генов ced-9 и ced-3. Один из таких гомологов, Bcl-2, функционально может заменять ced-9 у C. elegans. Другие гомологи, включающие каспазу 3, тесно связаны с ced-3. Ced-4 же является единственным геном, чего-либо соответстующего которому не найдено у млекопитающих. Биохимическая роль белка CED-4 не была установлена.
Одним из ключевых этапов исследования является создание in vitro системы, позволяющая изучать апоптоз на цитозольных фракциях, полученных из нормально растущих клеток линии HeLa. Эта система позволила выявить новые белковые факторы, вовлеченые в каскад апоптоза. Одним из них является белок, известный как переносчик электронов, цитохром c, участвующий в активации каспазы 3.
Помимо цитохрома с, активация каспазы 3 происходит при участии фактора активации аптотической протеазы (Apaf-1). Это белок весом в 130 кД, содержащий домены гомологичные белкам CED-3 CED-4 на N-конце и WD_40 повторы на C-конце.
Результаты
Фракционирование цитозоля и реконструкция процесса активации касапазы 3
Наличие активности каспазы 3 выявлялось с помощью SDS-PAGE электрофореза его белка-предшественника. Наличие пробега (являющимся продуктом реакции протеолиза предшественника) говорит о наличии активности белка в пробе. Эта проба соответствовала клеточной фракции, в которой присутствовали dATP, Apaf-1 и цитохром c. Это значит, что эти компоненты принимают участие в одном и том же каскаде реакций, ведущем к апоптозу.
Очистка Apaf-1
Для этого была проведена процедура в шесть стадий, последней из которых была колончатая хроматография, в результате которой выделили белковую элюцию массой в 130 кД. После эту же фракцию подвергли SDS-PAGE электрофорезу, в результате которой был выявлен полипептид массой в ~130 кД, что показывает, что в растворе Apaf-1 содержится в виде мономера. В итоге была получена чистая проба белка объемом 10 мкг.
Секвенирование и кДНК клонирование Apaf-1
Белок был подвержен водействию эндопептидаз (трипсина и Lys-C), в результате чего получены 17 пептидов. Их последовательности были определены с помощью масс-спектрометрии и секвенирования по Эдману. Поиски белков, идентичных Apaf-1 не дали положительных результатов. Вырожденные олигонуклеотиды, кодирующие 2 и 4 пептиды, были использованы в качесте праймеров в DOP-PCR с бибилиотекой кДНК линии клеток HeLa, использовавшейся в качестве матрицы. В итоге были выявлены две перекрывающиеся последовательности кДНК с открытой рамкой считывания, кодирующей 1194 аминокислотных остатка, суммарная масса которых составляет 136,088 Дальтон. Стоп-кодоны, находящиеся в рамке считывания были идентифицировани в 5' нетранслируемой области кДНК, что означает, что полученные кДНК клоны кодируют белок Apaf-1 полностью.Доменная структура Apaf-1
Поиски по базам GenBank и Prosite показали что C-концевой участок белка содержит 12 WD-40 повторов. Также было выявлено, что N-концевой участок схожа с расмотренными ранее белками CED-3 и CED-4.
Связывание Apaf-1 с цитохромом c
Как было выяснено выше, активация Apaf-1 требует наличия цитохрома c и dATP. Но чтобы установить, что цитохром c связывается с белком непосредственно, была получена кроличья имунная сыворотка с антителами на Apaf-1. После был проведен Вестерн-блотинг с антителами к белку Apaf-1 или к цитохрому c. Результаты покала, то имунная сыворотка осадила Apaf-1. Однако неимунная сыворотка, полученная из того же кролика не осадила белок. В свою очередь имунная сыворотка осаждала и цитохром c вместе с белком Apaf-1, показывая, что они, нахожясь вместе, образуют комплекс.
Это статья 1997 года. Хочу заметить, что с тех пор было выяснено немало моментов и нюансов, касающихся роли белка Apaf-1 в процессе апоптоза, но и (насколько известно мне) не найдено никаких фактов, противоречащих выводам, сделанным в результате данной научной работы.