Секвенирование ДНК по Сэнгеру и анализ хроматограмм.

Задание №1

Для выполнения работы мной были скачены прочтения прямой и обратной цепочки секвенируемой ДНК. forward_read

reverse_read

Таблица 1. Границы нечитаемых участков.

	Участок в начале	Участок в конце
Прямая цепочка	проблем нет	727-836 нуклеотид
Обратная цепочка	1-179 нуклеотид	проблем нет

Forward-прочтение

Высокий шум мешает определить примерно 100 нуклеотидов в сиквенсе.

Reverse-прочтение

Высокий шум мешает определить первые 20 нуклеотидов в сиквенсе, а до 179 нуклеотида он сохраняется достаточно высоким. Минимальный уровень шума наблюдается примерно с 150 по 500 нуклеотид, к 550 букве он повышается, но детектировать нуклеотиды все еще возможно. примерно после 800 нуклеотида детекция уже невозможна.

Уровень шума по отношению к уровню сигнала определялся на глаз. Уровень шума для нуклеотидов до 179 и после 800 позиций составляет более 40%, что мешает интерпретировать результаты секвенирования.В центральной области секвенирования уровень шума не превышает 10%.

Общая оценка

Визуальная оценка неравномерности сигнала: для прямого и обратного прочтений характерны соотносимые по высоте пики в середине и сильно разбросанные по высоте пики в начале и конце обоих последовательностей.

Визуальная оценка неравномерности шума: в начале и конце прямого и обратного прочтений пики имеют разнообразную,пересекаются или сливаются, в середине последовательности пики а хроматограмме хорошо различимы, сигналы небольшого фонового загрязнения не мешают детекции. Вырезанные проблемные участки каждого прочтения можно восстановить по другой цепи.

*За референсную было взято обратное прочтение для более полного результата, такое выравнивание выглядило лучше.

Итак, с помощью программы UGENE был получен консенсус.

Consensus sequence

Выравнивание

После выравнивания прямого и обратного прочтения, редактирования всех нечитаемых участков вручную, с помощью blastn NCBI была найдена последовательность генов идентичная консенсусной — KR920030.1 Scoloplos acutissimus voucher W.44175.001 18S ribosomal RNA gene, partial sequence . Reference sequence

Выравнивание на референс:

fastafile

Решения по проблемным нуклеотидам

Довольно четко видно, что 268 позиция — С, это также подтверждается по комплементарности. Причной полиморфизма может служить разное расстояние между сигналами, вследствие чего пики могут растягиваться, перекрываться, накладваться.

Видно, что 286 позиция — A, это также подтверждается по комплементарности.Причной полиморфизма может служить разное расстояние между сигналами, вследствие чего пики могут растягиваться, перекрываться, накладваться.

Однозначно видно, что 298 позиция — T, это также подтверждается по комплементарности. В хроматограмме в данном месте наблюдаются пики одинаковой высоты, это может быть вызвано: Гетерозиготностью, соматической мутацией, несколько разных образцов ДНК, несколько генов в разных локусах, ошибками во время ПЦР.

Однозначно видно, что 298 позиция — T, это также подтверждается по комплементарности. Появление вторых пиков и перекрывание нуклеотида A нуклеотидом G.

Задания два

Для ознакомления с примерами очень плохих хроматограмм я зашла в директорию bad и взяла оттуда файл.

Проблема - пятно краски. Может возникнуть из-за ошибок во время фореза.