История запросов и результатов PubMed
| Запрос | Запрос как его понял PubMed | Всего находок | Всего в открытом доступе | Всего обзоров |
| ("p300"[Title]) OR p300[Title] | "p300"[Title] OR p300[Title] | 2615 | 845 | 77 |
| ((p300[Title]) OR p300[Title]) AND function[Title/Abstract] | (p300[Title] OR p300[Title]) AND function[Title/Abstract] | 544 | 254 | 15 |
| ((p300[Title]) OR p300[Title]) AND regulation[Title/Abstract] | (p300[Title] OR p300[Title]) AND regulation[Title/Abstract] | 351 | 236 | 11 |
| ((p300[Title]) OR p300[Title]) AND pathway[Title/Abstract] | (p300[Title] OR p300[Title]) AND pathway[Title/Abstract] | 154 | 93 | 2 |
| (((p300[Title]) OR p300[Title]) AND regulation[Title/Abstract]) AND pathway[Title/Abstract] | ((p300[Title] OR p300[Title]) AND regulation[Title/Abstract]) AND pathway[Title/Abstract] AND "loattrfree full text"[sb] | 50 | 33 | 2 |
Коллекция публикаций о белке р300
Ссылка на коллекцию: коллекция публикаций
Краткое описание статьи
Название статьи:
A Novel Function of Novobiocin: Disrupting the Interaction of HIF 1α and p300/CBP through Direct Binding to the HIF1α C-Terminal Activation Domain.
Авторы статьи: Wu D, Zhang R, Zhao R, Chen G, Cai Y, Jin J.
Абстракт:
HIF1α является важным клеточным белком обеспечивающим выживание в условиях гипоксии, он регулируюет клеточный ответ на низкое давление кислорода с помощью задействования транскрипционных коактиваторов p300/CBP. p300/CBP индуцирует экспрессию нескольких генов, вовлеченных в выживаемость клеток, деление, ангиогенез и развитие опухоли. Таким образом, стратегия ингибирования гипоксического ответа в опухолях может быть нацелена на белок-белковые взаимодействия HIF1α и p300/CBP. В этой статье мы впервые документируем, что антибиотики аминокумарин, новобиоцин, непосредственно блокируют белок-белковые взаимодействия между HIF1α С-концевым активным доменом (CTAD) и цистеин-гистидин богатым (CH1) участком p300/CBP. Кроме того, новобиоцин уменьшает экспрессию генов контролируемых HIF1α, в частности CA9, которая связана с онкогенезом. В монослое клеточной культуры, новобиоцин ингибирует клеточное деление и образование колоний в линии MCF-7 человеческой аденокарциномы молочной железы и легких человека линии А549 клеток рака. Поисковые эксперименты показали, что рекомбинантный фрагмент из CTAD HIF1α частично восстановливает тормозящее действие новобиоцина на клеточное деление и образование колоний в MCF-7 клеток. Эти результаты показывают новый механизм действия новобиоцина, который имеет потенциал для инновационных терапевтических использований в лечении опухолей.
Методы и материалы:
Материалы
Anti-Flag (М2) агароза, анти-Flag (М2) моноклональное антитело, анти-Flag пептид, новобиоцина (N-1628), цисплатин (479306) и galdanamycin (G3381) были получены от Sigma Aldrich (St. Louis, MO) . Anti-HIF1α H206 (Cat # SC-10790) и анти-p300 N-15 (Cat # SC-584) кроличьи поликлональные антитела были получены от Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti-GST моноклональных антител (Cat # MAB1132) был из Abnova корпорации (Тайвань). Anti-HPC4 антител был от Roche Applied Science (Германия).
Приготовление ядерного экстракта из HeLa и афинная отчистка белков.
Из выращенных клеток был приготовлен экстракт. Клетки были лизированы. Из этих клеток выделили белки, которые модифицировали и экспрессировали в различныее бактериальные культуры, из которых в последствии были выделены путем афинной хромотографии.
Приготовление геля содержащего новобиоцин.
Затем был приготовлен гель, в котором со сефарозой связывался новобиоцин.
Клеточная культура и ее поддержание.
Клетки изначально были получены из АТСС (Американская коллекция типовых культур). Все клетки культивировали в среде DMEM c 5% глюкозой и 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 100 ед/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина, при температуре 37С в увлажненной атмосфере 5% СО2.
ПЦР с обратной транскриптазой (RT-PCR).
Были взяты клетки, которые выросли. Затем изолировали все имеющееся РНК из клеток. Из каждого образца было изъято по 1 мг РНК и использовано в качестве матрицы для продукции кДНКю Далее было проанализировано количество мРНК, отвечающих за интересующие их белки. Были проанализированы с помощью ПЦР количество различных РНК. Далее в статье описаны стадии проведения ПЦР.
Soft-агар образование колоний анализа.
Затем было рассмотрено как новобиоцин влияет на формирование колоний раковых клеток А549 и MCF-7. Они растили данные колонии в течении трех недель на среде без новобиоцина и на среде с новобиоцином. Через 3 недели колонии были окрашены кристаллфеолетом, закреплены буфером и было сфотографировано количество очагов образования колоний размером более 100 мкм.
Анализ клеточного роста.
Клетки выращивались в течении семи дней. Ежедневно с помощью гемациотометра наблюдали за уровнем роста в течении семи дней. Гемацитометр — это прибор, который считает количество клеток в проходящем через него в потоке.
Статистический анализ
Статистические сравнения были проанализированы с использованием теста Стьюдента. Значения P <0,05 считались статистически значимыми.
Результаты:
Новобиоцин может нарушить комплекс HIF1α CTAD/p300 CH1
НIF1α CTAD как известно, взаимодействует с P300, таким образом, чтобы подтвердить, что HIF1α непосредственно связывается с P300, мы разработали фрагменты HIF1α различной длины и включили эти фрагменты в вектор pET41 (рис. . 1А). Были сделаны конструкции из HIF1α 425 и HIF1α 776, которые были экспрессированы в E.coli и очищены посредством глутатион-сефарозной хронотографии (фиг. 1В). Для описания ингибирующий активности новобицина на HIF1α /P300 был проведен GST -анализ с GST-HIF1α 425 и GST-HIF1α 776. Новобицин заблокировал взаимодействие каждого HIF1α 425 и 776 с рекомбинантной Р300. Взаимодействие между сверхэкспрессивной HPC4-HIF1α и эндогенной Р300 в присутствие COCl2 в клетках HeLa так же ингибируется новобицином. Эти эксперементы показали, что новобицин нарушает взаимодействие между HIF1α c рекомбинантной Р300.
Новобиоцин специфически ингибирует взаимодействие между HIF1α CTAD и P300 CH1.
Чтобы узнать, является ли ингибирование новобиоцина на HIF1α CTAD/p300 CH1 конкретным, мы исследовали другие известные антибиотики или химиотерапевтические средства с подобным механизмом действия. Химиотерапевтических цисплатин (цис-платина-diamminedichloro [II]. CDDP) связывает ДНК, и в конечном итоге запускает апоптоз . В наших экспериментах, в отличие от новобиоцина, цисплатин не влияет на взаимодействие между HIF1α CTAD и P300 CH1 . Кроме того, новобиоцину и гельданамицин(как ингибитор Hsp90) могут связываться с С-концевыми АТФ связывающим сайтом и приводить к деградации белков Hsp90, гельданомицин не нерушает сложное взаимодействие между HIF1α/p300 CH1 , предлагая различные механизмы действия для новобиоцина и гельданамицина.
Новобиоцин непосредственно связывается с HIF1α CTAD
Для расширения наших экспериментов мы исследовали, может ли новобиоцин связывается непосредственно либо HIF1α CTAD, либо с P300 CH1. В результате данные эксперименты показали, что ингибирующие воздействие новобицина на HIF1α CTAD/Р300 достигается засчет прямого связывания HIF1α CTAD. Для того чтобы исследовать вопрос о том, как новобицин связывается с Р300 СН1 мы привели подобные эксперенемты с flag-P300 CH1. При этом выяснили, что он никак не влияет на P300 CH1.
Новобиоцин так же влияет на рост опухолевых клеток.