Практикум 15

СБОРКА DE NOVO

ПОДГОТОВКА ЧТЕНИЙ ПРОГРАММОЙ TRIMMOMATIC

Код доступа проекта по секвенированию бактерии Buchnera aphidicola - SRR4240359.
С сайта ENA, я скачал соответствующий файл в формате fastq.
Команда:
wget ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR424/009/SRR4240359/SRR4240359.fastq.gz

Затем я создал файл в формате fasta со всеми возможными адаптерами, которые нужно вырезать из прочтений.
Команда:
cat /mnt/scratch/NGS/adapters/* > adapters.fasta

Далее я удалил адаптеры (в adapters.fasta) из чтений в файле SRR4240359.fastq.gz с помощью программы Trimmomatic.
Команда:
java -jar /usr/share/java/trimmomatic.jar SE -threads 10 -phred33 -trimlog trim.log SRR4240359.fastq.gz SRR4240359_trimmed_adapt.fastq.gz ILLUMINACLIP:adapters.fasta:2:7:7

Потом с 3'-конца чтений я удалил нуклеотиды, которые не прошли порог качества (имели качество меньше 20), сохраняя при этом минимальную длину в 32 нуклеотидов.
Команда:
java -jar /usr/share/java/trimmomatic.jar SE -threads 10 -phred33 -trimlog trim2.log SRR4240359_trimmed_adapt.fastq.gz SRR4240359_full_trimmed.fastq.gz TRAILING:20 MINLEN:32

ПОДГОТОВКА K-МЕРОВ С ПОМОЩЬЮ ПРОГРАММЫ VELVETH

С помощью программы velveth я сформировал директорию (Assembly_SRR4240359) с k-мерами (k-меры длиной 31) из обработанных чтений.
Команда:
velveth Assembly_SRR4240359 31 -short -fastq.gz SRR4240359_full_trimmed.fastq.gz

СБОРКА ЧТЕНИЙ НА ОСНОВЕ K-МЕРОВ С ПОМОЩЬЮ ПРОГРАММЫ VELVETG

В конечном итоге с помощью программы velvetg я сделал сборку.
Команда:
velvetg Assembly_SRR4240359

N50 и его длина

Длины трёх самых длинных контигов

Контиги с аномально большим или аномально малым покрытием

Нужную информацию я получил с помощью слудующих команд:
tail -1 Log (Отсюда я узнал N50)
sort -n -r -k 2 stats.txt | cut -f 2,6| head -n 3 (Длина и покрытие самых длинных контигов)
grep "125674" contigs.fa (Искал по длинам в contigs.fa)
grep "108447" contigs.fa (Аналогично)
grep "71403" contigs.fa (Аналогично)
(Причечательно, что покрытие в stats.txt и contigs.fa отлючаются на одну миллионную, в таблицу записал из stats.txt)
sort -n -k 6 stats.txt | less (Просматривал контиги с длиной больше 31)
grep '2.032258' contigs.fa (И искал по их покрытиям в contigs.fa)
sort -n -r -k 6 stats.txt | less (Аналогично)
grep '109.500000' contigs.fa (Аналогично)
grep -A 2100 '>NODE_11_length_125674_cov_44.550949' contigs.fa (Для удобного копирования последовательности из терминала)
grep -A 1810 '>NODE_1_length_108447_cov_42.009186' contigs.fa (Аналогично)
grep -A 1200 '>NODE_14_length_71403_cov_39.411552' contigs.fa (Аналогично)

АНАЛИЗ КОНТИГОВ

Ниже представлены карты локального сходства, полученные в результате выравнивания алгоритмом megablast с длиной слова 28 по отдельности трёх самых длинных контигов на геном Buchnera aphidicola (AC: CP009253). Каждые контиги картировались по 25, 15 и 14 участкам соответственно. Между ними участки, не имеющие гомологов в геноме. Их характеристики также представлены ниже.

ПОДВЕДЕНИЕ ИТОГОВ

Контиги картировались практически друг за другом, покрывая почти половину генома бактерии. Но они картировались с достаточного большим количеством разрывов. Контиги 11 и 14 оказались инвертированными по отношению к геному бактерии. Также 11 контиг наложился на точку начала последовательности генома бактерии.