° Прямая цепь
° Обратная цепь

Для просмотра хроматограмм и редактирования автоматического прочтения использовалась программа Chromas (Lite). В программе были открыты оба исходных файла, при этом файл с обратной цепью был переведен в комплементарную цепь с помощью команды Edit -> Reverse+Complement. Затем для обоих последовательностей был настроен одинаковый масштаб по горизонтали и было произведено выравнивание двух последовательностей с использованием поиска подслов Find.
Таблица 1. Координаты нечитаемых 5'- и 3'-концов (по прямой цепи).

Оценка хроматограмм:

Средняя сила сигнала ≈ 1000-1200. Шум распределен равномерно. Сигнал преобладает над шумом ≈ в 15 раз. Разброс значений сигнала наблюдается ≈ от 300 до 2300, следовательно, это наименьшее и наибольшее значения на имеющейся хроматограмме. Сила сигнала не зависит от имеющегося нуклеотида (пример: максимальная сила сигнала принадлежит цитозину, но в тоже время для данного нуклеотида имеются пики с невысоким значением; подобные примеры наблюдаются неоднократно).



Сигнал преобладает над шумом в такой же пропорции, как и в прямой цепи. Средняя сила сигнала ≈ 1100-1200. Шум также распределен равномерно. Разброс значений сигнала наблюдается ≈ от 340 до 2450, следовательно, это наименьшее и наибольшее значения на имеющейся хроматограмме. Сила сигнала не зависит от имеющегося нуклеотида по той же причине, что имелась и у прямой цепи.


Далее было необходимо проанализировать последовательности и отредактировать их, сравнивая результаты двух хроматограмм и исправляя потенциально возможные ошибки программы.
Все исправления внесены строчными буквами.
С помощью Jalview было получено выравнивание исправленных последовательностей (тех их частей, которые ранее были признаны читаемыми).
На основании полученнных данных была составлена итоговая нуклеотидная последовательность:
° Исправленная прямая цепь [ссылка]
° Исправленная обратная цепь [ссылка]
° Итоговая последовательность в fasta-формате[ссылка]
° Jalview проект с выравниваним прочтений прямой и обратной последовательности [ссылка]


На рисунках показаны некоторые из произведенных мною замен.

#1
° Выделенный программой нуклеотид был ею не определен в виду наложения сигналов друг на друга. Ориентировашись по обратной цепи, заменен на необходимый.


#2
° Нуклеотид обратной цепи не был определен из-за слишком слабого сигнала, который почти не отличается от окружающего шума. Поэтому решение принималось на основании хроматограммы прямой цепи (сверху указана прямая цепь, снизу - обратная).


#3
° Нуклеотид обратной цепи не был определен из-за высокого, конкурирующего с сигналом, уровня шума. Однако на прямой цепи уровень шума в этой позиции минимален и виден очень четкий сигнал для. Поэтому в эту позицию был поставлен цитозин (сверху указана прямая цепь, снизу - обратная).


#4
° Нуклеотид обратной цепи не был определен из-за слишком слабого сигнала, который почти не отличается от окружающего шума. Поэтому решение принималось на основании хроматограммы прямой цепи

Ниже предоставлено изображение в качестве примера плохой хроматограммы.[ссылка]


Здесь прослеживается высокий уровень шума, наложение несколько пиков друг на друга. Скорее всего, в образце было одновременно несколько различных фрагментов ДНК. Такую хроматограмму прочесть нельзя.