Отчёт по практикуму 8

Определение таксономии и функции последовательности из практикума 6

В практикуме 6 фигурировала некая последовательность, секвенированная по Сэнгеру. Сейчас же для нас перестанет быть загадкой природа той последовательности.

Первым делом я запустил blastn по Nucleotide collection, используя в качестве запроса консенсусную последовательность из шестого практикума, потому что было неизвестно, чего ожидать. Самыми близкими находками стали цитохромоксидазы из митохондрий кольчатых червей, причём сходство было весьма велико (а РНК встречались исчезающе мало), поэтому я провёл затем и megablast (так как много сходных образцов) наряду с blastx (так как ген кодирует белок).

Выдача megablast так дифференцировала находки: 4 образца Polycirrus medusa со счётом от 1110 до 1218, затем 16 Polycirrus sp., у которых от 784 до 983 баллов. Ближайшие соседи в списке относятся к тому же семейству Terebellidae, что и род Polycirrus, набирая 592 балла и менее. Чтобы проверить, какое сходство вообще может быть между последовательностями, принадлежащими червям данного семейства, я скачал несколько примеров из выдачи и запустил blastn suite-2sequences (megablast). Вот что было скачано:

• Последовательность, которая имела лучший счёт и была первой в выдаче. Она выступала в роли первой в двух выравниваниях.
• Последовательности всех находок из рода Polycirrus.
• Последовательности худшей находки из рода Polycirrus и 4 следующих за ней.
• Последовательности двух худших находок Polycirrus medusa и двух следующих по списку.
• Последовательность одной из находок — Polycirrus phosphoreus. Её я выровнял со всеми последовательностями рода.

Рисунки 1-3 иллюстрируют результаты выравниваний.

Анализируя результаты, можно заключить, что исходный запрос явно принадлежит роду Polycirrus, так как именно с образцами этого рода счёт превышал 750 (даже 780), а E-value было равно нулю. (У разных родов семейства обычно до 600). Даже, скорее всего, виду P. medusa, потому что счёт выравнивания между разными видами обычно был меньше 1000, а у изучаемой последовательности с этим видом было больше 1100.

Интересно, что при blastx (кстати, генетический код был выбран Invertebrate Mitochondrial) первые результаты — при сортировке по E-value принадлежали не роду Polycirrus. Это связано с тем, что последовательность P. medusa в банке неполная (как и нуклеотидные последовательности были partial cds, так и здесь есть пометка partial). Некоторые более длинные записи имеют больше совпадений с запросом и, как следствие, выигрывают в счёте, однако только с P. medusa наблюдается 100% identity. Какие белки были найдены, можно увидеть на рисунке 4. (Практически все имеют одну функцию).

Итак, с большой уверенностью можно утверждать: запросом был фрагмент гена цитохром c-оксидазы 1 кольчатого червя Polycirrus medusa.

Сравнение трёх алгоритмов BLAST

Теперь нужно сравнить результаты работы трёх запусков BLAST: megablast, blastn с параметрами по умолчанию, blastn с самыми чувствительными настройками.

Нужно было исследовать и последовательность из задания 1, и одну из CDS вируса из практикума 7 (выбранная). В таблице 1 приведены параметры запусков BLAST.

Отдельно покажем таксоны, в которых шёл поиск для червя и для вируса. (См. рис. 5-6).

Таблица 2 показывает число находок алгоритмов.

Megablast во всех случаях нашёл выравнивания с identity от 76%. Разные параметры запуска blastn не так сильно отличаются по выдаче для червя, как для фага. Там только добавились последовательности с ещё меньшим процентом совпадений и счётом (см. рис. 7), при том это всё ещё цитохромоксидазы.

Для вируса megablast нашёл родственные вирусы, blastn добавил 3 сборки бактерий, на которых данный фаг паразитирует, и некоторое количество других, уже близко не связанных; изменение параметров только увеличило число этих «других». Так как последовательность предположительно кодирует фактор репликации, то и встречаться он теоретически может много где. Есть и фрагменты с малым покрытием, напоминающие спейсеры из CRISPR-кассет к каким-то родственным последовательностям:

Query  1027     TTTGGCGTTCGCGTTGTTGAGCCACATCACGATGCAACCCCGCACTGGCATATGCT  1082
                ||||||||||| ||||  ||||| ||||||||||  || || ||||||||| ||||
Sbjct  1551554  TTTGGCGTTCGTGTTGCCGAGCCTCATCACGATGGCACACCACACTGGCATTTGCT  1551609

(Выравнивание с Vibrio rotiferianus AM7 DNA, chromosome 2, complete genome — AP019799.1).

Гомологи в неаннотированном геноме

Нужно было выбрать три типично эукариотических белка и проверить наличие их гомологов в сборке Amoeboaphelidium protococcarum X5 с kodomo.

Я выбрал тубулин (альфа-1 субъединицу), гистон H3.1, обратную транскриптазу-теломеразу. Нашёл нужные ID в Swiss-Prot, а затем выполнил команды:

• seqret sw:h31_mouse h31.fasta
• seqret sw:tba1a_mouse tubulin.fasta
• seqret sw:tert_mouse rt.fasta
• tblastn -query h31.fasta -db X5.fasta -db_gencode 6 > h31.hits
• tblastn -query tubulin.fasta -db X5.fasta -db_gencode 6 > tubulin.hits
• tblastn -query rt.fasta -db X5.fasta -db_gencode 6 > rt.hits

Использована таблица генетического кода 6, потому что она упоминалась на странице вида в NCBI Taxonomy. Полученные файлы: h31.hits, tubulin.hits, rt.hits. Для всех трёх белков результат положительный. Охарактеризуем достоверные находки (см. табл. 3).

У тубулина высокое сходство между альфа- и бета-субъединицами, поэтому среди находок, вероятно, обе. В целом тубулин и гистон оказались намного более консервативны, чем обратная транскриптаза (может быть, это связано с тем, что они выполняют структурную функцию, а теломераза — только каталитическую). Наличие малоконсервативных регионов отражено и на странице фермента в Pfam. Каталитические и трансмембранные домены расположены после 450-й аминокислоты, а этот участок и попал в выравнивание.

Поиск гена белка в контиге

Требуется взять контиг или скэффолд в неаннотированном геноме и найти в нём наиболее достоверный ген белка.

В геноме, который я рассматривал в практикуме 7, белки аннотированы, поэтому я нашёл новый. Потом я выбрал скэффолд длиной около 40 килобаз. Поиск гомологов был выполнен на сайте NCBI BLAST (blastx по refseq_protein, таксон Chlorophyta/Embryophyta group (taxid:33090)).

Самый большой счёт набрал ген пируваткиназы. Приведём его выравнивания с первым результатом из выдачи, не имеющим пометки PREDICTED (plastidial pyruvate kinase 4, chloroplastic isoform X1 [Camellia sinensis], Sequence ID: XP_028077586.1).

• Range 1: 165 to 615
  

  Query  39429  RNYVVSATNLIHYLALKCLDVEQLKEDLSSVGLLNLETINPCVIANLTAGIQILENLKSC  39250
                R Y+VSA NLIHYLALKCLDVEQLKEDLSS+GLLNLETIN  V+A+L+AG Q+LENLKS 
  Sbjct  165    RKYLVSAANLIHYLALKCLDVEQLKEDLSSIGLLNLETINSHVLASLSAGTQMLENLKSN  224
  
  Query  39249  PMSIKENTGGEISNRKSLDKHKKGEIIIDTMRRKASSNMQLLLGPLAEERTAHIMVTVGQ  39070
                 +  KE+    I  +KSLD  KKGE  I+ MR KA  N + LLGPL EERT HIMVTVGQ
  Sbjct  225    SLDRKESVVEGIFTQKSLDIQKKGEFTINVMREKACFNRESLLGPLQEERTTHIMVTVGQ  284
  
  Query  39069  EVTESEMLITDILKRGATVIRINCAHGNPSIWSEIIRRVRRSSQMLEKPCRILMDLAGPK  38890
                EV ESE LITD++  G T+IRINCAHGNPS+WSEIIRRV+RSSQMLEKPCRILMDLAGPK
  Sbjct  285    EVLESETLITDLVTTGTTIIRINCAHGNPSVWSEIIRRVKRSSQMLEKPCRILMDLAGPK  344
  
  Query  38889  LRTGKMKAGPCVVKISPKKNAYGDIVLPAQVWLCHKGANPPAGHISPDAILSIDGQEFLN  38710
                LRTGK+KAGPC +KISPKKNA G+++ PAQVWLC K A PP  ++SPDA++S+DGQEFL+
  Sbjct  345    LRTGKLKAGPCAMKISPKKNARGEVIFPAQVWLCPKQAGPPPANLSPDAVISVDGQEFLS  404
  
  Query  38709  KLQVGDTVRLRDARGRKRSLKICKRFPIFAGTAFMAECSRTAYVESGTQLYMKRQKGRSA  38530
                KL++GD V+  DARG++R LKI ++FP+F+G   MAECS+TAYV+SGT+LY+K +KG+  
  Sbjct  405    KLELGDAVKFFDARGKQRILKISQKFPVFSGVGLMAECSKTAYVQSGTELYIKGKKGKFT  464
  
  Query  38529  IGEVVEVPSVEQYVRLRVGDLLIISRESSVGMVELTETAIDAYRVTCSSNYLFDSVKPGD  38350
                +G +V++P+VE +VRLRVGDLLIISR+SS   +  T   I A+++TC S YLFDSVKPG 
  Sbjct  465    VGLMVDIPAVEPFVRLRVGDLLIISRDSSDDQIASTGATIGAHKITCCSGYLFDSVKPGQ  524
  
  Query  38349  PIAFDDGKIWGIIQGASASEIIVSITHASPKGTKLGAEKSINIPESSIKFEGLTTKDLMD  38170
                PIAFDDGKIWG+IQG S SEIIVSITHA  +GTKLG+EKSINIPES+I+FEGLT+KDL D
  Sbjct  525    PIAFDDGKIWGMIQGTSISEIIVSITHAGLRGTKLGSEKSINIPESNIRFEGLTSKDLKD  584
  
  Query  38169  LEFVAAHADMVGISFIRDVCDIVVLQAELEK  38077
                L+FVA+HADMVG+SF+RDV DI+VL+ ELEK
  Sbjct  585    LDFVASHADMVGVSFVRDVRDIIVLRQELEK  615

• Range 2: 632 to 708
  

  Query  37839  GFEKLPLLLLEAMKSSNPLGVMIARGDLAVECGWERLGDIQEQILSICSAAHVPVIWATQ  37660
                GFE LPL+LLEAMKS NPLGVMIARGDLAVECGWERL DIQE+I+SICSAAH+PVIWATQ
  Sbjct  632    GFENLPLMLLEAMKSPNPLGVMIARGDLAVECGWERLADIQEEIISICSAAHIPVIWATQ  691
  
  Query  37659  VLESLVKSGVPTRAELT  37609
                VLESLVK GVPTRAE+T
  Sbjct  692    VLESLVKFGVPTRAEIT  708

• Range 3: 616 to 630
  

  Query  37945  RKLQNLGIVLKIETQ  37901
                R+LQNLGI+LKIET+
  Sbjct  616    RRLQNLGIILKIETK  630

• Range 4: 3 to 165
  

  Query  41080  MKS*FIDIRHNTSSFVFQAIPTANIFYSRSSMPSGNVRALQFRLKIKNSVFRYQIFPLFL  40901
                M S  I +  N ++    AI TAN    RS+   G        L +K  VFR +I  L  
  Sbjct  3      MGSSSICVVTNQATLSNYAIQTANTSNFRSTNFLGKFTYQPSILHLKELVFRDKIAQLLK  62
  
  Query  40900  KEKGSLAPTTLVFSTQNESDESESGNSQSCIEDQIHVALENNDVSRYP-DVEVAPFTHSE  40724
                +++ + APTT+VF+  NE+DE+E G S +  +DQ+  A ENN   + P D  VA  +   
  Sbjct  63     RQRRNPAPTTIVFAIPNENDEAERGISHTFTDDQMLTASENNGNFKDPGDEVVASLSQLG  122
  
  Query  40723  TDLSQSAEQLGNQGNLLDKLKAVHLHILAMEQWNASRIKLCHR  40595
                + LSQ+A  L NQ +LLDKLKAV LH+LAMEQWNASR+KLCHR
  Sbjct  123    SGLSQNAVSLENQADLLDKLKAVQLHVLAMEQWNASRLKLCHR  165

• Range 5: 715 to 759
  

  Query  36974  RANCIMLNKGKHVVDAISTLDVILQSKSTKMKAELKPLVLSSHLF  36840
                R++CIMLNKGKH+++A+STLD IL   STK+KAEL+PL++S+HLF
  Sbjct  715    RSSCIMLNKGKHILEAVSTLDNILHGNSTKVKAELRPLIISNHLF  759

Для этой находки суммарный счёт составил 1031; E-value 0,0; 69,62% identity — то есть можно уверенно утверждать гомологию.