Сборка de novo.

В данном практикуме было предложено поработать с транскриптомом резушки Arabidopsis thaliana. Для этого в рабочую директорию /nfs/srv/databases/ngs/s.kozyulina/G был скопирован архив

1. Подготовка чтений.

Команда Результат выполнения команды

gunzip G.fastq.gz Разархивирует G.fastq.gz. Итог: в папке G получен и лежит файл G.fastq

seqret
Read and write (return) sequences
Input (gapped) sequence(s): /P/y16/term3/block3/adapters/*
output sequence(s) [prefixpe_1.fasta]: adapters.fasta Все адаптеры были собраны в единый файл adapters.fasta

java -jar /usr/share/java/trimmomatic.jar SE -phred33 G.fastq G_no_adapters.fastq ILLUMINACLIP:adapters.fasta:2:7:7 Cоздан файл G_no_adapters.fastq с последовательностью без адаптеров.
Результат: Input Reads: 3869869 Surviving: 3869408 (99,99%) Dropped: 461 (0,01%)

java -jar /usr/share/java/trimmomatic.jar SE -phred33 G_no_adapters.fastq G_clean.fastq SLIDINGWINDOW:5:28 MINLEN:32 Убирает плохие буквы с концов. Программа Trimmomatic проходит скользящим окном (SLIDINGWINDOW) длины 5 по каждому прочтению и убирает части ридов после любого окна со средним качеством ниже 28. При этом удаляет прочтения, которые после очистки оказались короче 32 букв - считаем, что они доверия не заслуживают.
Результат: Input Reads: 3869408 Surviving: 3420217 (88,39%) Dropped: 449191 (11,61%).

2. Сравнение исходных и очищенных чтений.

Число прочтений до Trimmomatic - 3869408, размер файла - 979 М
Число прочтений после Trimmomatic - 3420217, размер файла - 797 М

График "Per base quality" из программы FastQC для исходного чтения и чтения после чистки соответственно.

3. Создание 31-меров.

Подготовка 31-меров (множества всех возможных последовательностей рида длины 31) проводилась с помощью программы velveth (подпрограммы программы velvet). Velveth выдаёт файлы Sequences (с самими последовательностями) и Roadmaps (с информацией об этих последовательностях). Эти файлы необходимы для дальнейшей работы velvetg.

Команда: velveth velveth 31 -fastq -short G_clean.fastq
Выдача: директория velveth с файлами Log, Sequences и Roadmaps

4. Сборка по графам де Брайна.

Приступаем к velvetg - одной из программ, реализующих сборку генома методом граф де Брайна. Velvetg создает файлы contigs.fa (с последовательностях всех собранных контигов) и stats.txt (c информацией о контигах, стоящих в вершинах графа)

Команда: velvetg velveth
Выдача: "Final graph has 446888 nodes and n50 of 28, max 606, total 6826334, using 0/3420217 reads", в директории velveth созданы файлы Graph, LastGraph, PreGraph, contigs.fa, stats.txt.

Можем анализировать полученную информацию.
N50 = 28, количество вершин = 446888

Длина short1_cov short1_Ocov

Самые длинные контиги (1 строка - NODE_325832)

606 14.40429 14.136964

590 3.523729 3.523729

589 2.597623 2.597623

Контиг с максимальным покрытием (NODE_189196)

1 4662508 4662508

Контиг с минимальным покрытием (NODE_326415)

43 1 1

Средние значения

15.27527 259.1113 166.4185

5. Аннотация найденных контигов с помощью BLAST

Контиг Банковская аннотация лучшей находки Покрытие контига Процент идентичности

NODE_325832 Accesion - NM_123430.2
Arabidopsis thaliana succinate dehydrogenase 2-2 (SDH2-2), mRNA 100% 100%

NODE_189196 Accesion - NM_001332684.1
Arabidopsis thaliana Late embryogenesis abundant (LEA) hydroxyproline-rich glycoprotein family mRNA 100% 100%

NODE_326415 Accesion - NM_121381.4
Arabidopsis thaliana Acyl-CoA N-acyltransferases (NAT) superfamily protein mRNA 75% 98%

Команда	Результат выполнения команды
gunzip G.fastq.gz	Разархивирует G.fastq.gz. Итог: в папке G получен и лежит файл G.fastq
seqret Read and write (return) sequences Input (gapped) sequence(s): /P/y16/term3/block3/adapters/* output sequence(s) [prefixpe_1.fasta]: adapters.fasta	Все адаптеры были собраны в единый файл adapters.fasta
java -jar /usr/share/java/trimmomatic.jar SE -phred33 G.fastq G_no_adapters.fastq ILLUMINACLIP:adapters.fasta:2:7:7	Cоздан файл G_no_adapters.fastq с последовательностью без адаптеров. Результат: Input Reads: 3869869 Surviving: 3869408 (99,99%) Dropped: 461 (0,01%)
java -jar /usr/share/java/trimmomatic.jar SE -phred33 G_no_adapters.fastq G_clean.fastq SLIDINGWINDOW:5:28 MINLEN:32	Убирает плохие буквы с концов. Программа Trimmomatic проходит скользящим окном (SLIDINGWINDOW) длины 5 по каждому прочтению и убирает части ридов после любого окна со средним качеством ниже 28. При этом удаляет прочтения, которые после очистки оказались короче 32 букв - считаем, что они доверия не заслуживают. Результат: Input Reads: 3869408 Surviving: 3420217 (88,39%) Dropped: 449191 (11,61%).

Длина	short1_cov	short1_Ocov
Самые длинные контиги (1 строка - NODE_325832)
606	14.40429	14.136964
590	3.523729	3.523729
589	2.597623	2.597623
Контиг с максимальным покрытием (NODE_189196)
1	4662508	4662508
Контиг с минимальным покрытием (NODE_326415)
43	1	1
Средние значения
15.27527	259.1113	166.4185

Контиг	Банковская аннотация лучшей находки	Покрытие контига	Процент идентичности
NODE_325832	Accesion - NM_123430.2 Arabidopsis thaliana succinate dehydrogenase 2-2 (SDH2-2), mRNA	100%	100%
NODE_189196	Accesion - NM_001332684.1 Arabidopsis thaliana Late embryogenesis abundant (LEA) hydroxyproline-rich glycoprotein family mRNA	100%	100%
NODE_326415	Accesion - NM_121381.4 Arabidopsis thaliana Acyl-CoA N-acyltransferases (NAT) superfamily protein mRNA	75%	98%