Учебный сайт
Заиры Сефербековой

Исходные данные

Был дан белок (Sequence ID: YP_184698.1) археи Thermococcus kodakarensis KOD1^[1]. Необходимо было выполнить несколько заданий.

Задание 1

Выборка гомологов белка при помощи программы BLASTP из базы Refseq.
Я запустила BLASTP на сайте NCBI с параметрами по умолчанию для аминокислотной последовательности своего белка.
Результаты поиска можно скачать.

Число находок: 394. Из них 242 находки, гомологичные моему белку по всей длине (query cover > 80%). При этом для многих из них E-value >1 (например, для последовательности с идентификатором WP_014560618.1 E-value = 3,6). Это говорит том, что оценивать гомологичность белков только по длине выравнивания неправильно. Для трех находок (лучшей, худшей и любой из середины списка) в таблице 1 приведена краткая характеристика. Видно, что лучшая и худшая находки очень сильно различаются по достоверности, в то время как находка из середины списка примерно такая же по характеристикам, что и худшая. При этом худшая находка имеет E-value 9.8, что показывает недостоверность выравнивания. Это говорит о том, что BLAST дает излишне много результатов, и отсеивать неподходящие всегда нужно самому.
Из находок, приведенных в таблице, можно считать гомологом целой исходной последовательности только одну последовательность ("лучшая находка"). Из всех 394 находок 90 последовательностей можно считать гомологом целой исходной последовательности. Условный критерий: E-value < 1e-3 и Query cover > 70%.

Выравнивания (построенные blastp)

Лучшая находка

Открыть в формате: FASTA, MSF.

Худшая находка

Открыть в формате: FASTA, MSF.

Находка из середины списка

Открыть в формате: FASTA, MSF.

Задание 2

Множественное выравнивание последовательностей из выборки.
Была сохранена выборка из 24 полных последовательностей гомологов моего белка + его последовательность в формате fasta. Затем было построено выравнивание в Jalview с помощью программы Muscle (раскраска BLOSUM62). Для нахождения вертикальных блоков использовался следующий список групп аминокислотных остатков (на основании данных о частотах мутаций):

KR
ST
LIVM
FYW
DN
EQ
P
G
A
H
С

В выравнивании общие для всех последовательностей вертикальные блоки обозначены "В", а блоки для части последовательностей — "Н" в строке разметки "Blocks". По выравниванию видно, что блоков для разных групп последовательностей намного больше, однако и для всех последовательностей их довольно много. Это свидетельствует о том, что находки гомологичны между собой, а не только исходному белку, что, в принципе, логично.
На С-конце оказалось много длинных невыровненных участков, различных у разных находок. Но при более тщательном изучении было найдено множество блоков для групп последовательностей. Возможно, это обусловлено схожей функцией белков, чьи последовательности входят в эти группы. На N-конце таких последовательностей найдено не было. Опять же это можно объяснить тем, что для этих белков консервативность N-конца важна для выполнения их функций, в то время как С-конец может различаться.
Открыть выравнивание в формате: FASTA, MSF.

Задания 3, 4

Глобальное и локальное парные выравнивания данного белка и худшей находки из выборки (ID: WP_010867708.1).
Использовались консольные программы needle и water на kodomo. Для получения парного выравнивания из построенного множественного были удалены все остальные последовательности. Также было взято выравнивание, полученное BLAST. Таким образом, четыре полученных выравнивания:
- глобальное (выданное needle)
- глобальное (полученное из множественного)
- локальное (выданное water)
- локальное (выданное BLAST)
были помещены в одно окно в JalView и объединены в 4 соответствующие группы. Затем было сделано выравнивание полученных выравниваний между собой. Для этого в JalView смещались обе последовательности в соответствующих группах. Колонки, которые одинаковы в разных выравниваниях находятся друг под другом. В некоторые выравнивания были вставлены гэпы. Группы следуют в вышеуказанной очередности.
Участок, найденный программами BLAST и water (4 и 3 группа соответственно), совпал неполностью. Выравнивания, полученные этими программами, различаются на участках, где консервативных нет блоков, т.е. консервативные колонки могут быть получены по-разному, что вполне нормально. Тем не менее, длина выравнивания и вертикальные блоки совпали достаточно хорошо, что говорит о взаимозаменяемости этих программ. Такие участки для удобства в проекте Jalview отмечены * в строке разметки "colons".
В то же время, абсолютно совпали выравнивания, полученные программами needle и water (не считая того, что программа water не дала на выход недостоверно выравненный С-конец). Хуже всего с остальными совпадает выравнивание, полученное удалением из множественного выравнивания лишних последовательностей, что и ожидалось.

Рисунок 1. Участок, на котором выравнивания различаются

Как уже упоминалось, в общем выравнивании были участки, на которых выравнивания различаются. Один из них приведен на рис.1. Его длина составляет 25 а.о. Это связано с большим числом гэпов и маленьким количеством корсервативных колонок, которые могут быть получены при разных выравниваниях. Поэтому такие участки не несут достоверной информации о гомологичности.

Задание 5

Парные выравнивания последовательностей двух заведомо негомологичных белков.
Для этого задания в пару моему белку был взят негомологичный белок. Краткую информацию о нем можно узнат из таблицы 2.

Для общего выравнивания использовалось два выравнивания, полученных при помощи программ water и needle. Далее вставлялись гэпы для выравнивания их выравниваний относительно друг друга. Ниже приведен участок, содержащий общие колонки (различающиеся N- и C-концы можно посмотреть в проекте). Видно, что общих колонок практически нет, т.е. выравнивания существенно различаются, что говорит об их недостоверности. Из этого можно сделать тот же вывод, что и из различия в выравниваниях на участках с большим числом гэпов (см. предыдущее задание): слабо гомологичные последовательности (участки последовательностей) выравниваются неточно и разными алгоритмами (программами) по-разному. А значит, в этом случае найденные колонки не свидетельствуют ни о чем конкретном. Опять же: все нужно анализировать самому, так как программа на это не способна.

Проект Jalview со всеми заданиями: скачать.

Примечания:

[1] Информацию о белке можно прочитать здесь.