Предсказание генов эукариот



1. Описание скэффолда




Рис. 1. Созревающий V. vinifera1
В первом задании я буду описывать скэффолд NW_003724208. Он принадлежит Винограду культурному. Систематика: 
 Домен:     Eukaryota 
 Царство:   Viridiplantae
 Тип:       Embryophyta
 Отдел:     Magnoliophyta 
 Класс:     Magnoliopsida
 Порядок:   Vitales
 Семейство: Vitaceae
 Род:       Vitis
 Вид:       V. vinifera
V. vinifera — культурный вид винограда. Плоды не только употребляются в пищу в свежем виде, но и используются для приготовления вина сока, уксуса. Виноград культурный растёт в умеренных и субтропических регионах, широко культивируется во многих странах. В диком виде виноград культурный неизвестен. Современный культурный виноград отличается от всех диких подавляющим преобладанием обоеполых цветков, является ветроопыляемым, насекомоопыляемым и самоопыляющимся растением. Сорт винограда характеризует отличительную совокупность передаваемых по наследству морфологических, биологических и хозяйственных признаков. Редактировать какие-то признаки существующего сорта можно путем генных модификаций.
V. vitifera — это диплоидное растение с 38 (2n) хромосомами. Небольшой геном организма имеет размер около 500 Мб. Всего было три проекта по секвенированию генома этого организма, результаты были предоставлены EMBL (сборка GCA_000003745.2)1,2.

Немного информации о скэффолде NW_003724208: Для этого соответствующая запись была найдена в БД Nucleotide и открыта в геномном браузере. Далее вручную был найден ген, для которого по данным базы данных предсказывается альтернативный сплайсинг (рис. 2). В качестве продуктов трансляции мРНК предсказаны 2 изоформы фумарилацетоацетат-гидролазы (ФАА гидролазы).
Рис. 2. Изображение гена, для транскрипта которого предсказан альтернативный сплайсинг
Ссылки на записи для вариантов мРНК и соответствующих изоформ на сайте NCBI:
  1. мРНК: XM_010647896.2, изоформа X1: XP_010646198.1
  2. мРНК: XM_010647897, изоформа X2: XP_010646199.1
На рис. 3 и 4 показаны домены упомянутых изоформ.

Рис. 3. Изоформа X1
Рис. 4. Изоформа Х2


Таким образом, в состав изоформы Х2 помимо ФАА-гидролазы и N-концевой ФАА-гидролазы входит еще и BAG-домен. Что же это за домены?

ФАА гидролаза— фермент, гидролизующий фумарилацетоацетат с образованием фумарата и ацетоацетата (в ходе катаболизма тирозина). Мутации, вызывающие дефект в ферменте, приводят к накоплению катаболитов тирозина. У людей, например, мутации в ФАА-гидролазе вызывают тирозинемию, приводящую к повреждению почек, печени, периферических нервов и т.д.
N-концевая ФАА-гидролаза — домен, имеющий неохарактеризованную функцию. Имеет конформацию бочонка, как у SH3-домена.
BAG-домен — домен-регулятор активности шаперона Hsp70, предотвращающего мисфолдинг белков и и их дальнейшую агрегацию, стимулируя рефолдинг денатурированных белков3. Bag1, к примеру, образует с Hsp70 комплекс и ингибирует рефолдинг белков4.

Мне непонятно, зачем BAG-домен входит в состав изоформы Х2. blastp не нашел похожих белков, в состав которых тоже входил бы этот домен (нашлись только гомологи изоформы Х1). Возможно, это какая-то ошибка машинного анализа.

UPD: 26.11 NCBI изменил запись обсуждаемого скэффолда, убрав тот самый транскрипт, в продукте которого содержался BAG-домен. Теперь ссылка на него, приведенная выше, не работает. В геномном браузере участок, приведенный на рис.2, выглядит следующим образом:

Рис. 5. Участок после изменения аннотации


Единственное возможное объяснение такой внезапно смены аннотации после того, как я сделала задание, — NCBI следит за моим сайтом. Что ж, оставим это на их совести.

2. Предсказание генов и белок-кодирующих областей в выданном скэффолде



Для выполнения задания использовался web-сервер AUGUSTUS (режим Prediction). Входные параметры: 
    AUGUSTUS parameter project identifier: arabidopsis
    Genome file: vitis.fasta
    User set UTR prediction: true
    Report genes on: both strands
    Alternative transcripts: few
    Allowed gene structure: predict any number of (possibly partial) genes
    Ignore conflictes with other strand: false
Для параметров модели был выбран организм Arabidopsis thaliana (Резуховидка Таля), т.к. согласно современной системе классификации цветковых растений APG III порядок Brassicales, которому принадлежит этот вид, ближе всех из предложенных в AUGUSTUS к порядку Vitales, к которому принадлежит наш виноград (см. рис.5).
Также в параметрах я установила предсказание UTR, т.к. судя по GenBank они есть. Еще было отмечено наличие нескольких альтернативных транскриптов, которые тоже есть в записи (мы рассматривали один из примеров в п.1.). Все остальные параметры совпадают с параметрами по умолчанию. В таблице 1 приведено описание полученных файлов.


Рис. 5. Положение выбранных порядков (выделены)

Табл. 1. Описание полученных файлов
Файл Описание содержимого
predictions.tar.gz Архив со всеми файлами, выданными программой
augustus.gff Предсказания генов в формате .gff
augustus.gtf Предсказания генов в формате .gtf
augustus.aa Последовательности трансляций предсказанных генов в формате .fasta
augustus.cdsexons Предсказанные экзоны в формате .fasta
augustus.codingseq Предсказанные CDS в формате .fasta
augustus.gbrowse Координаты найденных генов, мРНК и т.д. для геномного браузера
augustus.mrna Предсказанные мРНК (с UTR) в формате .fasta


Так как сравнивать целиком гены в двух файлах проблематично, я сравнивала экзоны (вернее, все найденные CDS), полученные из обоих файлов .gff. Для того, чтобы сверить найденные CDS, был написан скрипт pr12.py. Затем с помощью команды (входные файлы: vitis.gff3, augustus.gff): 
  python pr12.py vitis.gff3 augustus.gff results.out
был получен файл results.out, содержащий координаты CDS, одинаковых в обоих файлах, а также общую статистику.

Прим. Некоторые координаты в выходном файле повторяются дважды. Это связано с предсказанием двух транскриптов, а, следовательно, CDS для них повторяются дважды. В записи GenBank такое тоже встречается. В качестве примера может служить обсуждаемый в п.1 ген фумарилацетоацетазы.

Таким образом, из 263 CDS, найденных AUGUSTUS, только 149 (84,65% от CDS в записи) совпадают с аннотированными в GenBank. Не найдено было 27 (15,34%) CDS, так что в принципе я бы сказала, что процент предсказанных так же, как в записи GenBank кодирующих последовательностей довольно высок. Однако помимо 149 верно найденных CDS, web-сервер нашел 114 (!), не аннотированных в GenBank. Так что несмотря на хороший процент верно найденных CDS, число неверно найденных слишком велико, чтобы говорить о высокой точности алгоритма. Возможно, выбор более близкого организма для параметров модели улучшил бы ситуацию.
Что касается обсуждаемого в п. 1 гена, AUGUSTUS тоже, как ни странно, предсказал 2 транскрипта (см. g.45). Однако С-конец был предсказан по-другому: последний экзон имеет координаты 268231..268106, в то время как в аннотации есть еще экзон 267452..267488 для транскрипта Х1 и + 266146..266855 для транскрипта Х2 (здесь говоря об экзонах имеются в виду и соответствующие участки CDS). Таким образом, частично веб-сервер смог предсказать обсуждаемый ген и даже сделал ту же ошибку, предсказав два трансрипта.

Ссылки:

[1] Виноград культурный // Wikipedia: the free encyclopedia. [URL]
[2] Vitis vinifera (wine grape) // National Center for Biotechnology Information. [URL]
[3] Conserved domains on [gi|731439310|ref|XP_010646199|] // National Center for Biotechnology Information. [URL]
[4] Ellen A. A. Nollen, Jeanette F. Brunsting, Jaewhan Song, Harm H. Kampinga, and Richard I. Morimoto (2000). Bag1 Functions In Vivo as a Negative Regulator of Hsp70 Chaperone Activity. Mol Cell Biol. 20(3): 1083–1088.