Дерево по нуклеотидным последовательностям. Паралоги

1. Построение дерева по нуклеотидным последовательностям

Последовательности 16S рибосомальной РНК каждой из бактерий из практикума были получены из файлов .frn (было выбрано по одной из копий гена) из базы полных геномов NCBI. Все они были записаны в общий файл rnas.fasta с соответствующими мнемониками для последовательности каждой бактерии. Затем полученный файл с выравниваниями был открыт в Jalview и было построено выравнивание алгоритмом Muscle с умолчательными настройками. На рис. 1 представлено полученое выраванивание. Выравнивание в формате .fasta: alignment.fa.
Полученное выравнивание было импортировано в MEGA и методом Neighbour-joinong было построено дерево, представленное на рис. 2.

Полученное дерево отличается от истинного взаимным расположением видов с мнемониками STAAR и GEOKA. Интересно отметить, что в случае построения дерева тем же методом, но по последовательностям белка, а не 16S-рРНК, получилось правильное дерево. Мне стало интересно, является ли это следствием того, что деревья, построенные по выравниваниям белковых последовательностей точнее отражают эволюционные взаимоотношения, чем деревья, построенные по выравниваниям нуклеотидных последовательностей и, в частности, 16S-рРНК. Поэтому я решила воспользоваться силами Google.

Ген 16S-рРНК присутствует во всех клетках; у бактерий в геноме может быть до 10 копий этого гена. Они часто используются для построения деревьев, т.к.:

• присутствуют во всех клетках;
• функция продукта одинакова во всех клетках;
• содержат как быстро, так и медленно эволюционирующие участки. Первые подходят для определения эволюционных взаимоотношений близких видов, а вторые — дальних;
• горизонтальный перенос генов рРНК если и происходит, то очень редко¹.

Таким образом, не совсем понятно, почему в этом случае дерево отличается от правильного. Более того, два других метода (минимальной эволюции и максимального правдоподобия) построили деревья с такой же топологией, как NJ (деревья не выкладываю). Такие результаты могут быть связаны с тем, что выравнивание нуклеотидных последовательностей менее достоверно, чем выравнивание белковых последовательностей, так как i) не учитывается, является ли замена нуклеотида синонимичной и ii) в выравниваниях аминокислотных последовательностей есть учет замены аминокислоты на аминокислоту со сходными свойствами и замены на аминокислоту с отличающимися свойствами, что делает выравнивание более точным; в выравниваниях нуклеотидных последовательностей такого, очевидно, нет.

Вывод: в общем, несмотря на приведенную цитату о возможности использования генов 16S-рРНК для построения деревьев, в моем случае этот способ сработал неидеально. Хотя, с другой стороны, строить дерево по последовательностям одной рРНК/одного белка — не самая лучшая идея.

2. Построение и анализ дерева, содержащего паралоги

Паралоги — гомологичные белки из одного организма. Ортологи — гомологичные белки из разных организмов или гомологичные белки, для которых разделение их общего предка на линии, ведущей к ним, произошло в результате видообразования. В данном задании предлагалось построить дерево гомологичных белку CLPX_BACSU белков моих бактерий. Затем, считая, что дерево построено верно, определить ортологов и паралогов, а также указать некоторые эволюционные события.

Сначала был создан файл с протеомами моих бактерий: proteomes.fasta, который был подан на вход blastp. Таким образом были найдены предполагаемые гомологи (порог e-value=0.001). В таблице 1 перечислены найденные гомологи.

Табл. 1. Найденные гомологи

Мнемоника	Продукт	Score	E-value
CLPX_BACAN	ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit ClpX	733	0.0
CLPX_GEOKA	ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit ClpX	712	0.0
CLPX_STAAR	ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit ClpX	607	0.0
CLPX_CLOTE	ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit ClpX	596	0.0
CLPX_CLOBA	ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit ClpX	593	0.0
CLPX_STRPN	ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit ClpX	541	0.0
HSLU_GEOKA	ATP-dependent protease ATPase subunit HslU	101	6e-24
HSLU_BACAN	ATP-dependent protease ATPase subunit HslU	97.8	1e-22
HSLU_STAAR	ATP-dependent protease ATPase subunit HslU	97.8	2e-22
Q5L436_GEOKA	ATP-dependent Clp protease ATPase subunit	65.9	6e-12
Q81VV9_BACAN	ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit ClpC	60.5	3e-10
A0A0H2USJ7_STRPN	ATP-dependent Clp protease, ATP-binding subunit	59.3	7e-10
Q890L5_CLOTE	Negative regulator of genetic competence mecB/clpC	57.4	3e-09
CLPL_STAAR	ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit ClpL	55.1	2e-08
CLPC_STAAR	ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit ClpC	53.9	4e-08
Q899V4_CLOTE	Negative regulator of genetic competence mecB	52.4	1e-07
A0A0H2UNL3_STRPN	Putative ATP-dependent Clp protease, ATP-binding subunit	47.0	5e-06
Q899H3_CLOTE	ATP-dependent zinc metalloprotease FtsH	45.1	2e-05
FTSH_STRPN	ATP-dependent zinc metalloprotease FtsH	45.1	2e-05
RUVB_CLOBA	Holliday junction ATP-dependent DNA helicase RuvB	42.7	1e-04
Q891B9_CLOTE	ATP-dependent zinc metalloprotease FtsH	42.7	1e-04
Y1421_STAAR	Uncharacterized protein SAR1421	42.0	1e-04
Q5L3T1_GEOKA	ATP-dependent zinc metalloprotease FtsH	42.0	2e-04
Q81VX5_BACAN	ATP-dependent zinc metalloprotease FtsH	41.6	2e-04
Q898D1_CLOTE	ATP-dependent zinc metallopeptidase	40.8	4e-04
CLPB_CLOTE	Chaperone protein ClpB	40.8	5e-04

Jalview почему-то не отбросил нижние семь находок (выделены курсивом), хотя их e-value выше порогового (0.001). Поэтому при построении выравнивания они не учитывались. Последовательности 19 найденных белков были загружены в Jalview и выровнены (Muscle with defaults). На рис.3 представлено полученное выравнивание (.fasta: alignment2.fasta). Выравнивание всех 26 находок можно посмотреть здесь. По приведенному выше выравниванию в MEGA было построено дерево (метод Neighbour-joining). Оно изображено на рис. 4.


Clp — эндопептидаза, катализирующая гидролиз белков в присутствии АТФ². Состоит из нескольких субъединиц: ClpP/ClpQ (обладают протеазной активностью) и ClpX/ClpC/ClpE/и др. (связывают АТФ). Этот белковый комплекс найден в бактериях, а также в митохондриях и хлоропластах эукариот³.
HlsVU — АТФ-зависимая протеаза, присутствующая у многих бактерий. Состоит из субъединиц: HslU (АТФ-зависимый шаперон и активатор второй субъединицы) и HslV (обладает протеазной активностью)⁴.
FtsH — АТФ-зависимая металлопептидаза (кофактор — ион цинка)⁵.

Таким образом, некоторые группы ортологов, представленные на дереве:

• CLPX_BACAN, CLPX_GEOKA, CLPX_STAAR, CLPX_CLOTE, CLPX_CLOBA, CLPX_STRPN: одна и та же субъединица ClpX;
• HSLU_GEOKA, HSLU_BACAN, HSLU_STAAR: одна и та же субъединица HslU;
• CLPC_STAAR, Q81VV9_BACAN: одна и та же субъединица ClpC;
• Q899H3_CLOTE, FTSH_STRPN: одна и та же субъединица FtsH

Все они кодируют определенную субъединицу, выполняющую одну и ту же роль в разных бактериях.

Принимая во внимание тот факт, что HslU и СlpX имеют схожее строение и функцию⁶, некоторые паралоги, представленные на дереве:

• CLPX_BACAN и HSLU_BACAN;
• HSLU_GEOKA и CLPX_GEOKA;
• CLPX_STAAR и HSLU_STAAR.

На рис. 5 отмечены все упомянутые группы гомологов, а также дупликации генов и разделение путей эволюции белков в результате видообразования.

Ссылки:

[1] James W. Brown. Molecular phylogenetic analysis using ribosomal RNA (rRNA). NC State University. [PDF].
[2] Gottesman S., Clark W.P., Maurizi M.R. (1990). The ATP-dependent Clp protease of Escherichia coli. Sequence of clpA and identification of a Clp-specific substrate. J. Biol. Chem. 265: 7886–7893.
[3] Katayama-Fujimura Y., Gottesman S., Maurizi M.R. (1987). A multiple-component, ATP-dependent protease from Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 262 (10): 4477–85.
[4] Rohrwild et al. (1996). HslV-HslU: A novel ATP-dependent protease complex in Escherichia coli related to the eukaryotic proteasome. Proc Natl Acad Sci U S A.93(12):5808-13.
[5] P0AAI3 (FTSH_ECOLI) // UniProt. [URL].
[6] Chuang et al. (1993). Sequence analysis of four new heat-shock genes constituting the hslTS/ibpAB and hslVU operons in Escherichia coli. Gene.134(1):1-6.