Мембранные белки

Описание белка

В этом практикуме нужно было описать расположение белка в мембране, а также попробовать предсказать его функции с помощью нескольких баз данных и сервисов.
Для работы мне был выдан белок с PDB ID 4RUF, образующий калиевые ионные каналы в клетках человека.

Каливые каналы — самый распространенный тип ионных каналов, найденный практически во всех живых организмах¹. Эти каналы участвуют и контролируют большое число клеточных процессов^2,3. Механическую и термическую активацию этих каналов связывают, к примеру, с термочувствительностью, чувствами осязания и боли.

Калиевые каналы из семейства TRAAK/TREK K(2P) (к которому и относится наш белок), участвуют в изменении возбудимости нейронов в ответ на давление, температуру, сигнальные липиды и анестетики⁴. Механизм все еще неизвестен.

На рис. 1 изображен описанный белок.

1. База данных OPM

База данных OPM (Orientation of Proteins in the Membrane) содержит предсказания о положении белков относительно мембраны. С помощью этой базы в первом задании необходимо было описать расположение выданного мне белка в мембране. Затем нужно было точно так же описать белок, в трансмембранной части которого не α-спирали, а β-листы. Мною был выбран белок с PDB ID 2JK4 — потенциалзависимый анионный канал во внешней митохондриальной мембране человека.

В таблице 1 приведена характеристика для двух исследуемых белков, а на рис. 2-3 их изображения по отношению к мембране (на этих изображениях внешняя мембрана окрашена красным, а внутренняя — синим).

Табл. 1. Информация о трансмембранных белках

Белок	4RUF (цепь А)	2JK4
Классификация	Тип: 1. Трансмембранные белки Класс: 1.1. Альфа-спиральные политопные белки Суперсемейство: 1.1.012. Ионные каналы (VIC) Семейство: 1.1.12.06. Двухпоровые каналы	Тип: 1. Трансмембранные белки Класс: 1.3. Бета-бочонковые трансмембранные белки Суперсемейств: 1.3.022. Митохондриальные и пластидные порины Семейство: 1.3.22.01. Потенциал-зависимые анионные каналы (VDAC)
Толщина гидрофобной части мембраны	31.8 Å	23.4 Å
Трансмембранные спирали/β-тяжи (а.о.)	1(30-53), 2(142-176), 3(196-218), 4(255-280)	1(29-36), 2(42-51), 3(58-65), 4(72-79), 5(84-90), 6(98-105), 7(115-122), 8(126-134), 9(141-148), 10(152-160), 11(170-176), 12(182-187), 13(193-199), 14(206-213), 15(222-228), 16(235-241), 17(246-252), 18(258-266), 19(277-285)
Среднее количество остатков в одной трансмембранной спирали (или одном β-тяже) белка	~ 15 а.о.	~ 8 а.о.
В какой мембране находится белок	плазматическая мембрана эукариот	наружняя митохондриальная мембрана

2. Анализ предсказания трансмембранных спиралей

В этом задании необходимо было оценить корректность результатов работы сервисов TMHMM и Phobius, которые используются для предсказания трансмембранных участков белков. Опишу сначала кратко принципы работы двух сервисов.

TMHMM (TransMembrane Hidden Markov Model) — метод определения трансмембранных спиралей белка на основе модели Маркова⁶. Он учитывает 7 возможных для а.о. положений относительно мембраны (рис. 4):

• в "ядре" трансмембранной спирали (transmembrane helix core), т.е. в средней части мембраны в области гидрофобных хвостов липидов;
• по две позиции в "кэпе" трансмембранной спирали (transmembrane helix caps), т.е. в периферийной части мембраны в области гидрофильных головок липидов (по одной для каждой поверхности мембраны);
• 3 позиции для петлей: по одной позиции для петли на цитоплазматической поверхности мембраны (cytoplasmic loop), две для соответственно короткой (short non-cytoplasmic loop) и длинной петли (long non-cytoplasmic loop) на наружной поверхности мембраны;
• одна позиция для глобулярного домена (globular) в центре каждой петли.

Для каждого а.о. рассчитывается постериорная вероятность нахождения в той или иной позиции, при этом все вероятности для всех а.о. связаны друг с другом. При расчетах используется метод максимального правдоподобия. При расчетах также приняты следующие положения:

• в кэп входит большое число полярных а.о., а общая длина кэпа составляет 5 а.о.;
• в ядре находится 5-25 по большей части гидрофобных а.о.;
• в петлях на цитоплазматической поверхности мембраны большое число положительно заряженных а.о.;
• для короткой и длинной петлей на внешней поверхности мембраны используются разные подходы, так как в отличие от коротких петлей длинные петли не всегда содержат маленькое число положительно заряженных а.о.

Кроме того, эта программа в небольшой части случаев способна отличать сигнальные пептиды (которые тоже содержат большое количество гидрофобных а.о.) от трансмембранных участков. TMHMM также отличает белки-порины от трансмембранных спиралей⁷.

Phobius во многом похожа на TMHMM, однако эта программа отличается способностью определять наличие сигнального пептида в белке. На рис. 5 показана схема модели, используемой в Phobius'е. Она отличается от модели TMHMM присутствием субмодели сигнального пептида, включающей n-, h-, c-участки и участок "cut".

Такое усовершенствование модели делает Phobius более точным инструментом, чем TMHMM⁸.

Перейдем теперь к самому заданию. Для его выполнения последовательность А цепи белка была подана на вход этим сервисам и результаты были сохранены в графическом и текстовом видах.

Обсудим сначала выдачу сервиса Phobius. На рис. 6, 7 приведены результаты работы программы в текстовом и графическом видах соответственно.



Как видно из рис. 6 и 7, сервис нашел 6 трансмембранных спиралей, в то время как в реальности их всего 4. Таким образом, было найдено 2 лишних спирали: 116-137 а.о. и 228-248 а.о. Кроме того, для верно найденных спиралей а.о. найдены неточно: сервис ошибся во всех четырех случаях как минимум на 2 а.о. Ну и персональная оценка: графический результат неудобен для восприятия, линии слишком жирные, а "пики" для трансмембранных спиралей какие-то кривые. В общем, ужасно некрасивый график (чем вообще часто грешат биоинформатические программы). С другой стороны, таблица мне тут кажется удобнее для чтения, чем в следующем сервисе.

Теперь обсудим выдачу сервиса TMHMM. На рис. 8, 9 приведены результаты работы программы в текстовом и графическом видах соответственно.




Как видно из рис. 8, 9 этот сервис также нашел 6 трансмембранных спиралей, т.е. 2 лишних: 113-135 а.о. и 226-248 а.о. В координатах остальных спиралей погрешности сравнимы с погрешностями предыдущего сервиса. Что касается личной оценки: график, на мой взгляд, в этом случае намного приятнее визуально, зато в таблица сложно воспринимается из-за включения названия входной последовательности в каждую строчку.

Выводы. В целом, результаты обоих сервисов примерно похожи. В обоих случаях координаты последних и начальных а.о. для верно найденных трансмембранных спиралей были определены неточно, а также было найдено 2 лишние трансмембранные спирали и там, и там. Это, скорее всего, реальные спирали 225-237 а.о. и 119-128 а.о., которые погружены в мембрану, но не пересекают ее насквозь и, видимо, поэтому в БД OPM они не аннотированы как трансмембранные спирали.
В общем, я бы не стала стопроцентно полагаться на результаты этих двух программ, если бы мне были нужны точные координаты трансмембранных спиралей/тяжей для некоторого неописанного белка, но для получения примерного представления его расположения в мембране я бы вполне охотно использовала эти сервисы (особенно второй, от графика первого болят глаза!).

3. База данных TCBD

В этом задании нужно было найти информацию об описанных в задании 2 белках в БД TCBD.
В базе данных транспортеров TCDB (Transport Classification DataBase) можно найти белки сходные с заданным в базе, почитать про них (со ссылками), посмотреть комплекс белков по одной субъединице, а также просто узнать классификацию некоторого белка и его возможные функции.
К сожалению, оба моих белка не представлены в этой БД, поэтому описывать мне нечего. Если будет нужно, опишу выданный белок с другим идентификатором.

Описание белков (доп. задание)

В ПРОЦЕССЕ Для белка 4RUF в разных базах данных было найдено описание:

• KEGG ORTHOLOGY: ID K04915;

Ссылки:

[1] Littleton J.T., Ganetzky B. (2000). Ion channels and synaptic organization: analysis of the Drosophila genome. Neuron, 26 (1): 35–43.
[2] Hille, Bertil (2001). Chapter 5: Potassium Channels and Chloride Channels. Ion channels of excitable membranes. pp. 131–168.
[3] Jessell T.M., Kandel E.R., Schwartz J.H. (2000). Chapter 6: Ion Channels. Principles of Neural Science (4th ed.). pp. 105–124.
[4] Lolicato M., Riegelhaupt P. M., Arrigoni C., Clark K. A., Minor D. L. (2014). Transmembrane Helix Straightening and Buckling Underlies Activation of Mechanosensitive and Thermosensitive K2P Channels. Neuron, 84 (6): 1198–1212.
[5] Human K2P4.1 (TRAAAK) potassium channel, W262S mutant // RCSB PDB. [URL].
[6] Erik L.L. Sonnhammer, Gunnar von Heijne, Anders Krogh. (1998). A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences. Proc.Sixth Int.Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology,175-182.
[7] Anders Krogh, Bjorn Larsson, Gunnarvon Heijne, Erik L. L. Sonnhammer. (2001). Predicting Transmembrane Protein Topology with a Hidden Markov Model: Application to Complete Genomes. J. Mol. Biol., 305: 567-580. [8] Lukas Ka ̈ll, Anders Krogh, Erik L. L. Sonnhammer. (2004). A Combined Transmembrane Topology and Signal Peptide Prediction Method. J. Mol. Biol. , 338: 1027–1036.