Реконструкция эволюции доменной архитектуры

Выбор домена и его описание

Для выполнения задания я выбрала домен ZZ zinc finger (ID: ZZ, AC: PF00569). Этот домен найден у 786 видов в составе 6142 последовательностей белков, и всего для него известно 536 архитектур.
Выбранный домен является одним из типов цинковых пальцев (анг. "zinc finger"). Домены этого типа связывают один или несколько ионов цинка посредством координационных связей с аминокислотами (обычно это 2 гистидина и 2 цистеина)¹. Белки, содержащие цинковый палец, в большинстве своем связываются с ДНК, РНК, другими белками или небольшими молекулами.
Конкретно мой домен содержит 4-6 остатков цистеина, которые связывают два иона цинка². Этот домен также содержит мотив Cys-X2-Cys, найденный в других цинковых пальцах. Считается, что цинковый палец типа ZZ участвует в белок-белковых взаимодействиях: к примеру, он был найден в таких белках, как Е3 убиквитин-лигаза и дистрофин.

На рис. 1 представлено изображение домена в составе Е3 убиквитин-лигазы MIB1 человека (PDB ID: 4XI6), а на рис. 2 и 3 — приближенное изображение взаимодействия двух координационных центров с ионами цинка (фиолетовые).

Построение выравнивания

Для выбранного домена было скачано выравнивание (Jalview: File → Fetch Sequences → Pfam (Full) → PF00569), которое затем было покрашено (ClustalX, порог консервативности=30). Также я добавила 3D структуру белка DTNA_HUMAN, последовательность которого выделена в выравнивании оранжевым цветом. Полученное выравнивание доступно в формате .fasta или в качестве проекта.
К сожалению, Jalview отказался сохранять изображение выравнивания (оно слишком большое), поэтому привести его здесь я не могу. Отмечу только, что в выравнивании очень много гэпов и очень мало консервативных позиций, не говоря о блоках. Это можно связать с большим числом последовательностей.

Выбор архитектур и их описание

Для моего домена известно всего 536 архитектур (пруф). Из них я выбрала вторую и третью архитектуры: {EF-hand_2, EF-hand_3, ZZ} и {ZZ, Myb_DNA-binding}. Они найдены в 507 и 349 последовательностях соответственно и представлены на рис. 4 и 5.


Сначала с помощью скрипта swisspfam_to_xls.py я отобрала последовательности с моим доменом из файла /srv/databases/pfam/swisspfam.gz, содержащего информацию об архитектуре всех последовательностей:

 python swisspfam-to-xls.py -z -i swisspfam.gz -p PF00569 -o archs.xls

Для полученной таблицы была составлена сводная таблица, в которой столбцами являются разные домены, а строками — идентификаторы белков. Исследуемый домен выделен красным, два белка из I — синим, а из II — зеленым. Затем для всех идентификаторов были скачаны соответствующие последовательности (Uniprot → Retrieve), для которых была получена таксономия с помощью скрипта uniprot_to_taxonomy.py:

 python uniprot-to-taxonomy.py -i uniprot.txt -o tax.xls

Полученная таблица с таксономией была добавлена к предыдущей. При этом я выбрала в качестве таксона было выбрано царство Metazoa (животные), а в качестве двух подтаксонов — Ecdysozoa или Линяющие (далее Е) и Chordata или Хордовые (далее С). Соответственно в столбце таксономии указаны царства и типы.

Затем с помощью небольшого скрипта я получила длины мотивов и вставила их в общую таблицу с помощью ВПР. Таким образом, была составлена таблица, представленная на листе architectures_selected, на котором выписана собранная информация о всех последовательностях. Из них было выбрано по 30 последовательностей для каждого из двух таксонов. Они отмечены "+" в колонке "selected" на упомянутом листе. Итоговая таблица: скачать.

Сохранив отдельно файл с нужной информацией, я получила два файла: ids_tax.txt с модифицированными идентификаторами и ids.txt с исходными идентификаторами при помощи несложного скрипта. Затем с помощью скрипта filter-alignment.py я оставила в выравнивании только выбранные мною последовательности:

 python filter-alignment.py -i align.fa -m ids.txt -o align_selected.fa -a "_"

Но и тут меня ждал подвох: в выравнивании осталось лишь 115 последовательностей из 120, то есть 5 последовательностей не были отобраны скриптом. Я нашла эти последовательности с помощью другого несложного скрипта и оказалось, что это Q9Y4J8, A2CI98, A2CJ06, Q8IYH5. Их идентификаторы в выравнивании отличались: DTNA_HUMAN, DYTN_MOUSE, DYTN_HUMAN, ZZZ3_HUMAN соответственно. Поэтому их мне пришлось вернуть в выравнивание вручную (спасибо, что их было всего лишь 4). К идентификаторам в полученном выравнивании с помощью скрипта я приписала выбранные обозначения для таксонов и архитектур: E1 и E2 для линяющих и C1 и C2 для хордовых в соответствии с архитектурой. соответствующие обозначения архитектур и таксонов. Итоговое выравнивание с отобранными последовательностями: align_selected.fasta.

Анализ выравнивания и дерева

После всех мучений полученный файл с выравниванием доменов выбранных последовательностей был открыт в Jalview, и я провела чистку выравнивания: были удалены пустые колонки, N- и C-участки; а потом создала две группы для архитектур и раскрасила их ClustalX (20%). Хочу отметить, что удалять последовательности я не стала, так как большая часть отличий характерна последовательностям E2. На рис. 6 представлено полученное выравнивание. Оно также доступно в виде проекта.

На изображении выравнивания видно, что для первой архитектуры последовательности домена содержат намного больше консервативных между таксонами позиций (и меньше гэпов, так как почти все гэпы обусловлены инделями в последовательностях для второй архитектуры). В целом, в выравнивании последовательностей со первой архитектурой можно выделить целые довольно большие вертикальные блоки, в то время как в последовательностях со второй архитектурой наблюдаются большие различия. Хочу также отметить, что для второй архитектуры у последовательностей значительно варьируются последние ~10 аминокислот (причем без привязки к таксону), которые консервативны у последовательностей со первой архитектурой. Зато с началом домена все в точности наоборот: у последовательностей со первой архитектурой первые 2 позиции в выравнивании не консервативны, а у последовательностей с второй архитектурой в первой позиции большое число сходных аминокислот (отличия, опять же, связать с таксономией не выйдет).
Вообще говоря, я бы сказала, что в обоих случаях вертикальные блоки присутствуют.


Для полученного итогового выравнивания было построено дерево с помощью программы MEGA методом Neighbour-joining с использованием bootstrap (100 реплик). Полученные деревья были сохранены в формате .nwk: дерево с длинами ветвей, дерево с бутстрэп-поддержкой ветвей. Построенное дерево было укоренено в ветвь, разделяющую последовательности по архитектуре. Затем я решила укоренить дерево в среднюю точку. Для этого файл с деревом был подан на вход программе retree и переукоренен в среднюю точку. Таким образом, я получила дерево с тем же корнем: оно представлено на рис. 7. Полученное дерево также доступно в классическом виде.




Как видно на рис.7, укоренение в среднюю точку привело к разделению дерева на две клады, соответствующие двум архитектурам. Разделения по таксонам четкого нет: "чужие" последовательности присутствуют в кладах другого таксона. Таким образом, как мне кажется, у предкового организма уже существовало две архитектуры для данного домена, которые затем эволюционировали в типах отдельно: хорошо видно, что внутри клад по архитектурам последовательности собраны в клады по типам, внутри которых последовательности сильно схожи.

Тем не менее, в некоторых кладах присутствуют последовательности из других таксонов. Мне стало интересно, можно ли это каким-то образом объяснить. К примеру, последовательность C3XQY6_BRAFL — это домен Branchiostoma floridae или хорошо известного всем ланцетника. Он относится к типу хордовые, но на дереве последовательность домена из его белка находится в кладе линяющих. Возможно, данный домен у ланцетника слабо эволюционировал, в связи с чем его последовательность близка к последовательностям линяющих из данной клады. Интересно также отметить, что для первой архитектуры ветвь C3YT60_BRAFL (тоже ланцетник) находится близко к ветвям A0A0B4KHE2_DROME и A0A0J7LAF9_LASNI, которые находятся в упомянутой кладе с II архитектурой с последовательностью ланцетника. Получается, можно проследить некоторую схожесть в эволюции этого домена у ланцетника и упомянутых линяющих. С чем это может быть связано — сложный вопрос.

Ссылки:

[1] Klug A, Rhodes D (1987). Zinc fingers: a novel protein fold for nucleic acid recognition. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 52: 473–82.
[2] Ponting CP, Blake DJ, Davies KE, Kendrick-Jones J, Winder SJ. (1996). ZZ and TAZ: new putative zinc fingers in dystrophin and other proteins. Trends Biochem. Sci. 21 (1): 11–13.