Профили подсемейства белков

*Сурикаты иллюстрируют "семейство"

Выбoр подсемейства

Сначала необходимо было выбрать подсемейство из выравнивания последовательностей домена, исследованного в прошлом праке.

Подсемейство будем считать хорошим, если оно является кладой на дереве и если есть некоторые признаки (доменная архитектура, таксономическая принадлежность или диагностические позиции), по которым можно отнести домен к данному подсемейству. Я решила выбрать подсемейство, выделенное в выравнивании на рис. 1. Они образуют кладу и имеют диагностические позиции (например, №1 и 4). Таким образом, в подсемействе 18 последовательностей, а длина выравнивания последовательностей их доменов 47. Выбранные последовательности были сохранены в отдельный файл в формате .fasta.

Построение профиля и поиск гомологов

Далее для полученного подсемейства необходимо было построить профиль. Для этого использовался пакет HMMER, использующий скрытые модели Маркова для анализа выравнивания последовательностей и поиска гомологов.

Сначала был построен профиль:

 hmm2build profile.out domains.fa

Полученный файл c профилем был откалиброван:

 hmm2calibrate profile.out

Затем я скачала с сайта UniProt полноразмерные последовательности белков, содержащих мой домен. По полученному файлу для итогового профиля был осуществлен поиск гомологов:

 hmm2search profile.out PF00569.fasta > findings.out

В итоговом файле findings.out содержатся все находки.

Анализ результатов

Для анализа результатов нам предложили использовать ROC-кривую и гистограмму весов находок.

ROC-кривая (Receiver Operator Characteristic)— кривая, которая наиболее часто используется для анализа качества моделей. ROC-кривая показывает зависимость количества верно классифицированных положительных примеров от количества неверно классифицированных отрицательных примеров. Рассмотрим возможные результаты:

• TP (True Positives) — верно классифицированные положительные примеры (так называемые истинно положительные случаи). В нашем случае — это количество последовательностей, расположенных выше некоторого порога и достоверно содержащих искомый домен;
• TN (True Negatives) — верно классифицированные отрицательные примеры (истинно отрицательные случаи). В нашем случае — это количество последовательностей, расположенных ниже некоторого порога и достоверно не содержащих искомый домен;
• FP (False Positives) — отрицательные примеры, классифицированные как положительные (ошибка II рода); Это ложное обнаружение, т.к. при отсутствии события ошибочно выносится решение о его присутствии (ложно положительные случаи). В нашем случае — это количество последовательностей, расположенных выше некоторого порога, но не содержащих домен;
• FN (False Negatives) — положительные примеры, классифицированные как отрицательные (ошибка I рода). Это так называемый "ложный пропуск" – когда интересующее нас событие ошибочно не обнаруживается (ложно отрицательные примеры). В нашем случае — это количество последовательностей, расположенных ниже некоторого порога и содержащих домен.

Для самого анализа, однако, важны не эти абсолютные значения, а относительные: специфичность и чувствительность. Специфичность (SP) — доля истинно отрицательных случаев, которые были правильно идентифицированы моделью (т.е. доля достоверно предсказанных белков, не содержащих домен, от общего количества последовательностей, известно не содержащих этот домен). Чувствительность (SE) — доля истинно положительных случаев (т.е. доля достоверно предсказанных белков, содержащих домен, от общего количества последовательностей, известно содержащих домен. Из определений следуют формулы, по которым считаются данные показатели:

• SP = TN/(TN+FP)
  
• SE = TP/(TP+FN)

С использованием этих знаний, были проанализированы результаты поиска гомологов по профилю. Для этого файл с находками был открыт в Excel (лист 'profile'). Затем на другом листе ('roc') для каждого значения порога были подсчитаны шесть описанных выше значения: TP, TN, FP и FN, а также SP и SN. Далее я также посчитала значения 1-SP и построила график зависимости: по оси ОY откладывается SЕ, по оси ОX — 1–SP (сто процентов минус специфичность). Полученный график и есть ROC-кривая. Результат приведен на рис. 2. Итоговая таблица: results.xlsx.
Далее я выбрала порог таким образом, чтобы SP и SE были одновременно максимальны. Это то же самое, что и максимальное значение SP+SE-1. Таким образом, порог составил 105, при этом SP=0.963 и SE=1. Как видно, модель профиля позволяет с большой достоверностью выделять подсемейство.

С помощью Excel также была построена гистограмма весов находок. Необходимая таблица и сама гистограмма находится на листе 'hist'. На рис. 3 представлен полученный график.

Таблица 1. Результаты поиска при выбранном пороге

Находок	принадлежит подсемейству	не принадлежит подсемейству	Сумма
выше порога по профилю	18	220	238
ниже порога	0	5798	5798
Сумма	18	6018	6036

Поиск гомологов с помощью psi-BLAST