Практикум 4. Поиск гомологов белка CLPX_ECOLI
Выбор организмов и подготовка деревьев
Для работы были выбраны следующие 7 организмов:
Таблица 1. Выбранные для работы организмы
| Мнемоника | Организм | Класс |
|---|---|---|
| ACICJ | Acidovorax sp. | Betaproteobacteria |
| AGRFC | Agrobacterium fabrum (ранее A. tumefaciens) | Alphaproteobacteria |
| HAEIN | Haemophilus influenzae | Gammaproteobacteria |
| NEIMA | Neiella marina | Gammaproteobacteria |
| PSEAE | Pseudomonas aeruginosa | Gammaproteobacteria |
| ROSDO | Roseobacter denitrificans | Alphaproteobacteria |
| SHEDO | Shewanella sp. | Gammaproteobacteria |
Протеомы этих бактерий были взяты из директории /P/y22/term4/Proteomes/ и объединены в файл database.fa, который был преобразован в базу данных/
makeblastdb -in database.fa -dbtype prot -out proteome_db
Была скачана последовательность белка CLPX_ECOLI (P0A6H1.fasta), которая была использована в качестве запроса для blastp.
blastp -query P0A6H1.fasta -db database.fa -evalue 0.0001 -outfmt 6 -out out_fmt6.txt
Список находок из выдачи blast – в общей сложности 22 находки
sp|Q12LA2|CLPX_SHEDO sp|Q9I2U0|CLPX_PSEAE sp|Q8UFY5|CLPX_AGRFC sp|P44838|CLPX_HAEIN sp|A5FX05|CLPX_ACICJ sp|Q165G0|CLPX_ROSDO sp|Q9JTX8|CLPX_NEIMA sp|Q9HUC5|HSLU_PSEAE sp|Q9HUC5|HSLU_PSEAE sp|Q12IT8|HSLU_SHEDO sp|Q12IT8|HSLU_SHEDO sp|Q16CY2|HSLU_ROSDO sp|Q16CY2|HSLU_ROSDO sp|Q8UJ87|HSLU_AGRFC sp|Q8UJ87|HSLU_AGRFC tr|A5FYD7|A5FYD7_ACICJ tr|A5FYD7|A5FYD7_ACICJ sp|P43773|HSLU_HAEIN sp|P43773|HSLU_HAEIN sp|Q168A2|RUVB_ROSDO tr|Q7CT50|Q7CT50_AGRFC tr|A5FVF9|A5FVF9_ACICJ
Возможно, при проверке также будут полезны выдача blast и список уникальных находок (без дублирования одних и тех же белков одних и тех же организмов – 16 находок)
Для удобства заголовки были отредактированы: оставлены только имена белков. Последовательности были извлечены в файл findings.fa Выравнивани было проведено программой muscle
muscle -align findings.fa -output aligned.fasta
Получен файл aligned.fasta, который с помощью программы phylip-conventer.py был конвертирован в формат выравнивания phylip-relaxed (aligned.phy). С помощью команды
iqtree -s aligned.phy -m TEST -bb 1000 -nt AUTO
было получено дерево (aligned.phy.treefile). Пояснения к опциям:
- -m TEST – указывает программе автоматически протестировать все доступные модели эволюции и выбрать наилучшую
- -bb 1000 – запуск ультрабыстрого бутстрепа с 1000 репликами
- -nt AUTO – автоматическое определение доступных ядер и их использование для ускорения бутстреп
Работа с деревьями
Рис. 1. Дерево, построенное с помощью IQ-Tree до укоренения. Bootstrap указан в процентах. (tree_unrooted.txt)
Рис. 2. Дерево, построенное с помощью IQ-Tree после укоренения в среднюю точку. Bootstrap указан в процентах. (tree_midpoint.txt)
Корень расположился на ветви, ведущей к белку RUVB_ROSDO. Это ожидаемый результат, так как RuvB является членом суперсемейства AAA+ АТФаз, но учавствует в репарациии ДНК и представляет из себя внешнюю группу по отношению lpX и HslU. Длинная ветвь к RuvB указывает на значительную эволюционнуюю дивергенцию.
Все остальные белки образуют единую монофилетическую группу, внутри которой чётко выделяются две крупные сестринские клады (поддержка узла, разделяющего их, составляет 93%):
- Клада ClpX – все белки с названием CLPX_* (7 белков, все из разных организмов)
- Клада HslU и паралоги – белки HSLU_* (5 белков из разных организмов) и еще несколько паралогов (A5FYD7_ACICJ, Q7CT50_AGRFC и A5FVF9_ACICJ)
Такая топология биологически обоснована: ClpX и HslU являются паралогами, возникшими в результате древней дупликации гена-предшественника в суперсемействе AAA+ АТФаз. Они выполняют схожие функции (являются АТФазными субъединицами протеазных комплексов: ClpXP и HslUV соответственно). Поэтому их совместное происхождение от одного предка и последующее разделение на две линии полностью соответствует эволюционной истории этих белков. Поддержка клад (72–96 для ClpX, 74–94 для HslU) говорит о надёжности реконструкции.
Ортологи и паралоги
Ортологи – белки из разных организмов, образующие монофилетические клады, соответствующие филогении видов.
Паралоги – белки из одного организма, которые находятся в разных кладах
Примеры ортологов и паралогов:
Ортологи:
- CLPX_ACICJ – CLPX_AGRFC
- CLPX_NEIMA – CLPX_SHEDO
- HSLU_HAEIN – HSLU_SHEDO
Паралоги:
- CLPX_PSEAE – HSLU_PSEAE
- CLPX_SHEDO – HSLU_SHEDO
- CLPX_AGRFC – HSLU_AGRFC
Окрашивание и "схлопывание" клад
Рис. 3. Дерево, построенное с помощью IQ-Tree после укоренения в среднюю точку и окрашивания ортологических групп. Bootstrap указан в процентах.
Рис. 4. Дерево,построенное с помощью IQ-Tree после укоренения в среднюю точку, окрашивания ортологических групп и их схлопывания. Bootstrap указан в процентах.
Схлопнуть группы CLPX и HSLU полностью не представляется возможным из-за особенностей топологии: CLPX и HSLU образуют единую монофилетическую группу, а в группе HSLU присутствует A5FYD7_ACICJ, который не является паралоом к HSLU.
В группе CLPX представлены белки ClpX из бактерий SHEDO, PSEAE, OSDO, AGRFC и ACICJ, филогения не соответствует реальной. Это может свидетельствовать о том, что ген clpX эволюционировал не строго по виду (возможны дупликации/потери, либо недостаточная разрешающая способность).
Если рассматривать ветви отдельно (здесь ветвь трактуется так, как указано в задании), то можно указать на конкретные сходства и различия:
- Ветвь (ROSDO, (AGRFC, ACICJ)): ROSDO сестринская к (AGRFC, ACICJ), хотя в реальности ACICJ является сестринской к (ROSDO, AGRFC).
- Ветвь (SHEDO, (PSEAE, (ROSDO, (AGRFC, ACICJ)))) объединяет SHEDO, PSEAE и всех альфа-представителей (ROSDO, AGRFC, ACICJ). В эталонном дереве эти виды не образуют единую кладу: SHEDO и PSEAE относятся к разным ветвям гамма-протеобактерий, а альфа-виды формируют отдельную группу (с участием других таксонов).
- Ветвь (PSEAE, (ROSDO, (AGRFC, ACICJ))) помещает PSEAE как сестринскую к альфа-группе, тогда как в эталонном дереве PSEAE должна быть в кладе с PSEMY и SACD2, а альфа-виды – отдельно.
- Ветвь (AGRFC, ACICJ) показывает этих двух альфа-представителей как ближайших родственников, однако в эталонном дереве ACICJ является внешней по отношению к кладе (ROSDO, AGRFC) (с учётом других видов, таких как PARDP и BRUSU).
- CLPX_NEIMA не входит в кладу с остальными CLPX, а располагается в одной ветви с HSLU и другими паралогами. Это противоречит ожидаемой ортологии, так как все CLPX должны образовывать монофилетическую группу.
- CLPX_HAEIN отделена от всех остальных CLPX, хотя в эталонном дереве HAEIN должна быть близка к SHEDO (в кладе (SHEDO, (HAEIN, ...))).
В группе HSLU представлены белки HslU из всех выбранных бактерий, кроме NEIMAфилогения соответствует реальной. Внутри неё чётко видны клады (ROSDO, AGRFC) и (SHEDO, HAEIN), а также положение PSEAE как сестринской к (SHEDO, HAEIN), что согласуется с референсным деревом.
Хотя здесь ACICJ имеет мнемонику A5FYD7, отличную от HSLU, его функция соответствует группе (ATP-dependent protease ATPase subunit HslU), поэтому его можно считать паралогом к HSLU.
Рис. 5. Рефересная филогения выбранных видов. Является поддеревом дерева, считаемого верным в рамках практикума. (tree_original_selected.txt)
