Отчет по практикуму 8
Введение
Выданный мне белок УДФ-2,3-диацилглюкозаминпирофосфатаза LpxI катализирует одну из реакций синтеза липида А у бактерии Caulobacter vibrioides (штамм ATCC 19089/CB15). Липид А является составной частью липополисахарида - основного компонента наружной мембраны грамотрицательных бактерий [1].
Caulobacter vibrioides (альтернативное название Caulobacter crescentus) - грамотрицательная олиготрофная бактерия из группы альфа-протеобактерий, обитающая в пресноводных водоемах. Для клеток характерна форма полумесяца [2]. У данного вида наблюдается диморфный цикл развития, включающий прикрепленную стадию со стебельком, и подвижную стадию, у которой имеется жгутик. При делении клетки со стебельком, одна из дочерних клеток остается прикрепленной к субстрату, а другая дифференцируется в жгутиковую стадию, неспособную к делению. Через некоторое время подвижная форма оседает на дно, отбрасывает жгутик, отращивает стебелек и восстанавливает способность к делению [3].Caulobacter vibrioides является модельным объектом для изучения цитоскелета и регуляции клеточного цикла у бактерий [3, 4].
Особенности фермента (по данным страницы в UniProt)
УДФ-2,3-диацилглюкозаминпирофосфатаза LpxI катализирует реакцию гидролиза пирофосфатной связи УДФ-2,3-диацилглюкозамина, посредством атаки водой бэта атома фосфора. Продуктами являются 2,3-диацилглюкозамин-1-фосфат (липид X) и УМФ. Это одна из стадий синтеза липида А - гидрофобной части липополисахарида наружной мембраны бактерии. В качестве кофактора могут использоваться ионы магния, в меньшей степени ионы марганца и кобальта. Большие концентрации ионов меди и цинка ингибируют фермент, ЭДТА полностью подавляет каталитическую активность in vitro.
Для белка известна 3D-структура: он локализован на внутренней мембране клетки и представляет собой гомодимер. Каждая половина димера содержит N-концевой субстрат-связывающий домен и C-концевой каталитический домен, подвижно соединенные между собой и способные сближаться для катализа.
Фермент LpxH катализирует аналогичную стадию синтеза липида А с теми же продуктами, используя те же реагенты, что и LpxI, но по другому механизму. В последовательностях LpxI и LpxH не наблюдается сходства, различны и таксоны, использующие эти ферменты. LpxI может заменять LpxH у штаммов E. coli с недостаточностью LpxH.
Поиск идентификатора белка по UniRef обнаруживает кластеры UniRef50_Q9A716, UniRef90_Q9A716, UniRef100_Q9A716. Во всех кластерах последовательность белка является representative, но не является seed. Кластер UniRef50_Q9A716 содержит 187 записей, практически все белки этого кластера, для которых известна функция катализируют ту же реакцию, что и данный фермент, и принадлежат организмам группы альфа-протеобактерий. Кластер UniRef90_Q9A716 содержит 8 записей, причем 7 из них принадлежат виду Caulobacter vibrioides, а оставшийся - невыясненному виду того же рода. Кластер UniRef100_Q9A716 содержит всего 5 записей, 4 из которых принадлежат разным штаммам Caulobacter vibrioides и один - невыясненному виду рода Caulobacter.
Поиск по запросам в Uniprot показывает, что ферменты с активностью, аналогичной исследуемому, не встречается у эукариот. Это логично, учитывая его функцию. LpxI встречается за пределами рода Caulobacter, однако намного реже, чем LpxH, катализирующий аналогичную реакцию (см. табл. 1).
| Запрос в UniProt | Количество результатов |
|---|---|
| ec:3.6.1.54 taxonomy:"Eukaryota [2759]" | 0 |
| ec:3.6.1.54 NOT taxonomy:"Caulobacter [75]" | 10641 |
| ec:3.6.1.54 gene:lpxh | 9838 |
| ec:3.6.1.54 gene:lpxi | 384 |
Выбор протеомов для сравнения
В качестве протеома, характеризующего организм, из которого был выделен исследуемый белок, я взял протеом с индентификатором UP000001816. Это референсный протеом штамма, белок которого был выдан для анализа. Он содержит 3720 белков, 573 из которых находятся в базе Swiss-Prot. Поскольку штамм Caulobacter vibrioides (strain ATCC 19089 / CB15) широко используется в лабораторной практике в роли модельного объекта, могу предположить, что этот протеом достаточно хорошо изучен.
Для сравнения я выбрал протеом с идентификатором UP000001868 - референсный протеом Phenylobacterium zucineum (strain HLK1). Протеом содержит 3838 белков, причем для 201 белка имеется запись в базе Swiss-Prot. Судя по количеству белков в Swiss-Prot, а также учитывая, что штамм Phenylobacterium zucineum (strain HLK1) описан относительно недавно, предположу, что этот протеом изучен не так хорошо, как UP000001816. Тем не менее, можно сказать, что UP000001868 изучен намного лучше, чем многие другие референсные протеомы видов, близких к Caulobacter vibrioides, которые не имеют ни одного белка в базе Swiss-Prot. Скорее всего, это связано с возможной патогенностью P. zucineum для человека.
Phenylobacterium zucineum (strain HLK1) входит в семейство Caulobacteraceae и филогенетически близок к роду Caulobacter, однако имеет ряд фенотипических отличий. В частности, для этой бактерии не показан двухфазный жизненный цикл, кроме того, P. zucineum факультативно поселяется внутри клеток человека, что было показано на клетках линии HeLa, а также линии клеток эритролейкимии человека K562. P. zucineum рассматривают как потенциально патогенный организм, хотя остается неясным, является ли он внутриклеточным комменсалом или же паразитом. Не известно также, способен ли он заражать нераковые клетки человека и млекопитающих [5, 6].
Я выбрал для сравнения протеом UP000001868, поскольку мне показалось интересным изучить отличия, связанные со способностью P. zucineum переходить к внутриклеточному существованию, а также с отсутствием двухфазного жизненного цикла, характерного для семейства Caulobacteraceae. Кроме того, данный протеом оказался одним из наиболее хорошо изученных протеомов организмов, близких к Caulobacter vibrioides.
Сравнение протеомов по представленности определенных групп белков
| Группа белков | Запрос в UniProt | Количество результатов | Доля белков данной группы |
|---|---|---|---|
| Трансмембранные белки | annotation:(type:transmem) AND organism:"Phenylobacterium zucineum (strain HLK1) [450851]" AND proteome:up000001868 | 655 | 17,07% |
| Ферменты | ec:* AND organism:"Phenylobacterium zucineum (strain HLK1) [450851]" AND proteome:up000001868 | 681 | 17,74% |
| Белки, связанные с вирулентностью | keyword:"Virulence [KW-0843]" AND organism:"Phenylobacterium zucineum (strain HLK1) [450851]" AND proteome:up000001868 | 5 | 0,13% |
| Белки клеточной адгезии | keyword:"Cell adhesion [KW-0130]" proteome:UP000001868 | 0 | 0% |
| Белки, связанные со жгутиком | keyword:"Flagellum [KW-0282]" AND organism:"Phenylobacterium zucineum (strain HLK1) [450851]" AND proteome:up000001868 | 41 | 1,07% |
| Группа белков | Запрос в UniProt | Количество результатов | Доля белков данной группы |
|---|---|---|---|
| Трансмембранные белки | annotation:(type:transmem) AND organism:"Caulobacter vibrioides (strain ATCC 19089 / CB15) (Caulobacter crescentus) [190650]" AND proteome:up000001816 | 664 | 17,85% |
| Ферменты | ec:* AND organism:"Caulobacter vibrioides (strain ATCC 19089 / CB15) (Caulobacter crescentus) [190650]" AND proteome:up000001816 | 689 | 18,52% |
| Белки, связанные с вирулентностью | keyword:"Virulence [KW-0843]" AND organism:"Caulobacter vibrioides (strain ATCC 19089 / CB15) (Caulobacter crescentus) [190650]" AND proteome:up000001816 | 3 | 0,08% | Токсины | keyword:"Toxin [KW-0800]" AND organism:"Caulobacter vibrioides (strain ATCC 19089 / CB15) (Caulobacter crescentus) [190650]" AND proteome:up000001816 | 2 | 0,05% |
| Белки клеточной адгезии | keyword:"Cell adhesion [KW-0130]" AND organism:"Caulobacter vibrioides (strain ATCC 19089 / CB15) (Caulobacter crescentus) [190650]" AND proteome:up000001816 | 3 | 0,08% |
| Белки, связанные со жгутиком | keyword:"Flagellum [KW-0282]" AND organism:"Caulobacter vibrioides (strain ATCC 19089 / CB15) (Caulobacter crescentus) [190650]" AND proteome:up000001816 | 15 | 0,40% |
Трансмембранных белков и ферментов в протеоме C. vibrioides оказалось немного больше, чем в протеоме P. zucineum. Это можно объяснить большей изученнотью протеома C. vibrioides, хотя я не уверен, что данные различия можно считать существенными. Белков, связанных с вирулентностью у P. zucineum оказалось больше, в то время как токсинов в сравниваемых протеомах оказалось примерно одинаковое количество. Большее разнообразие белков, связанных с вирулентностью у P. zucineum согласуется со способностью этого организма к жизни внутри клеток человека, однако различия опять же не так велики и могут быть сочтены статистически незначимыми.
В протеоме P. zucineum, в отличие от протеома C. vibrioides, не оказалось белков, ответственных за клеточную адгезию. Это было ожидаемо, поскольку двухфазный жизненный цикл C. vibrioides включает прикрепленную стебельчатую стадию, а для P. zucineum прикрепленных стадий не было обнаружено. Белков, связанных со жгутиком в протеоме P. zucineum в процентном соотношении оказалось более чем в 2,5 раза больше, чем в протеоме С. vibrioides. Дело в том, что жгутиковая стадия в жизненном цикле C. vibrioides не является продолжительной и служит для расселения на сравнительно небольшие расстояния, чтобы затем перейти к приклрепленному образу жизни. Поэтому логично, что жгутик P. zucineum, постоянно использующей его для передвижения, устроен более сложно, что выражается в большем разнообразии белков, ассоциированных с его работой.
Сравнение протеомов по другим параметрам
Я решил проанализировать первые 10 самых часто встречающихся ключевых слов у белков протеомов двух сравниваемых организмов с помощью Google Colab и Python. Программа, с помощью которой получены частоты ключевых слов доступна по ссылке. В табл. 4 и 5 представлены ключевые слова и количество белков, в аннотации которых они присутствуют.
| Ключевое слово | Количество белков, % |
|---|---|
| Reference proteome | 100.00 |
| Membrane | 20.38 |
| Transmembrane | 17.74 |
| Transmembrane helix | 17.46 |
| Transferase | 12.66 |
| Signal | 11.10 |
| Metal-binding | 8.42 |
| Plasmid | 8.31 |
| Hydrolase | 7.53 |
| Nucleotide-binding | 7.22 |
| Ключевое слово | Количество белков, % |
|---|---|
| Reference proteome | 100.00 |
| Membrane | 21.53 |
| Transmembrane | 18.47 |
| Transmembrane helix | 18.09 |
| Transferase | 11.56 |
| Signal | 10.11 |
| Metal-binding | 8.28 |
| Hydrolase | 7.45 |
| Nucleotide-binding | 7.23 |
| Cytoplasm | 6.64 |
Как видно из табл. 4 и 5, самые многочисленные группы белков у C. vibrioides и P. zucineum практически идентичны как по составу, так и по представленности в протеоме. Поскольку оба протеома референсные, то все белки имеют в аннотации ключевое слово Reference proteome. Также можно видеть, что существенная часть белков P. zucineum несет плазмида, у C. vibrioides же, по данным UniProt, плазмиды отсутствуют.
Я решил изучить, какие группы белков несет единственная плазмида pHLK1 P. zucineum. Для этого я определил 10 самых часто встречающихся ключевых слов в аннотации плазмидных белков и частоту их встречаемости в плазмиде с помощью Google Colab и Python (см. табл. 6). Программа, при помощи которой получены данные табл. 6 доступна по ссылке.
| Ключевое слово | Количество белков, % |
|---|---|
| Reference proteome | 100.00 |
| Plasmid | 100.00 |
| Membrane | 21.94 |
| Transmembrane | 20.69 |
| Transmembrane helix | 20.38 |
| Signal | 9.72 |
| Coiled coil | 9.40 |
| Nucleotide-binding | 8.78 |
| Transferase | 8.46 |
| ATP-binding | 7.84 |
| Stress response | 7.52 |
Среди плазмидных белков, по сравнению с общим протеомом, заметно больше белков, связанных с ответом на стресс. Могу предположить, что защита от стрессовых факторов является одной из функций данной плазмиды (насколько я знаю, защитная функция характерна для многих плазмид прокариот). Повышено также процентное содержание белков, содержащих мотив спиральной катушки (Coiled coil). Часто белки, имеющие этот мотив, участвуют в регуляции различных биологических процессов, а также являются транскрипционными факторами [7]. В остальном состав и частота наиболее часто встречаемых групп белков в плазмидном и полном протеомах P. zucineum различаются незначительно.
При помощи запросов в UniProt я решил выяснить, какая часть плазмидных белков, участвующих в сигналинге, содержит мотив спиральной катушки, а также сравнить этот показатель с аналогичным для неплазмидного протеома. Результаты представлены в табл. 7.
| Запрос в UniProt | Количество результатов |
|---|---|
| keyword:"Plasmid [KW-0614]" keyword:"Signal [KW-0732]" AND organism:"Phenylobacterium zucineum (strain HLK1) [450851]" AND proteome:up000001868 | 31 |
| keyword:"Plasmid [KW-0614]" keyword:"Signal [KW-0732]" keyword:"Coiled coil [KW-0175]" AND organism:"Phenylobacterium zucineum (strain HLK1) [450851]" AND proteome:up000001868 | 7 |
| keyword:"Signal [KW-0732]" NOT keyword:"Plasmid [KW-0614]" AND organism:"Phenylobacterium zucineum (strain HLK1) [450851]" AND proteome:up000001868 | 395 |
| keyword:"Signal [KW-0732]" NOT keyword:"Plasmid [KW-0614]" keyword:"Coiled coil [KW-0175]" AND organism:"Phenylobacterium zucineum (strain HLK1) [450851]" AND proteome:up000001868 | 27 |
Среди плазмидных белков, связанных с сигналингом, заметно большую долю (22,58%), чем в случае сигнальных белков неплазмидного протеома (6,84%), составляют белки, имеющие мотив спиральной катушки. Это может быть связано как с недостаточно хорошей аннотированностью протеома, так и со случайными причинами (все таки размер неплазмидного протеома в 10 раз больше). С другой стороны, это может свидетельствовать о биологической закономерности, требующей дальнейших исследований: к примеру, можно предположить, что значительную роль в регуляции ответа на стресс у P. zucineum играют белки, имеющие мотив спиральной катушки.
Источники
5. Wolf-Rainer A. et. al. "The Family Caulobacteraceae" The Prokaryotes. 11 Nov. 2014, pp 179-205.