Хромосома: вторая.

Команда	Что делает
fastqc chr2.fastq	Анализ качества секвенирования, выдает zip-архив и html-отчет
java -jar /nfs/srv/databases/ngs/suvorova/trimmomatic/trimmomatic-0.30.jar SE -phred33 chr2.fastq chr2_trimmed.fastq TRAILING:20 MINLEN:50	Обрезка с конца чтений нуклеотидов с качеством меньше 20 и отбрасывание чтений короче 50, выдает файл chr2_trimmed.fastq

Изображения из отчета fastqc
До trimmomatic

После trimmomatic

После триммирования от 10410 осталось 10191 ридов. Я считаю, что в данном случае процедура триммирования оправдана, т к в процентном соотношении удалено было немного ридов, но качество в среднем значительно улучшилось.

Команда	Что делает
PATH=$PATH:/home/students/y06/anastaisha_w/hisat2-2.0.5	Позволяет bash искать исполняемые файлы в указанной директории
hisat2-build chr2.fasta chr2_ref	Инсирует референсную последовательность, выдает ht2-файлы
hisat2 -x chr2_ref -U chr2_trimmed.fastq aligned.sam --no-spliced-alignment --no-softclip 2> aligned_pl.log	Выравнивает референсную последовательность и прочтения, также выводит log-файл
samtools view aligned.sam -bo aligned.bam	Переводит выравнивание в бинарный формат
samtools sort aligned.bam aligned_sorted	Сортирует выравнивание
samtools index aligned_sorted.bam	Индексирует выравнивание

Вывод hisat2 :

10191 reads; of these:
  10191 (100.00%) were unpaired; of these:
    47 (0.46%) aligned 0 times
    10140 (99.50%) aligned exactly 1 time
    4 (0.04%) aligned >1 times
99.54% overall alignment rate

Таким образом, 99,54% чтений было картировано на геном, из них 99,50% (10140) было картировано один раз и 0,04% (4) более одного раза. Почти все риды были однозначно картированы на геном, из этого можно сделать вывод о высоком качестве картирования.

Команда	Что делает
samtools mpileup -uf chr2.fasta -o chr2_snp.bcf aligned_sorted.bam	Создает файл с полиморфизмами в формате .bcf
bcftools call -cv chr2_snp.bcf -o chr2_snp.vcf	Переводит bcf в vcf

Координата	Тип полиморфизма	Референс/чтение	Глубина покрытия (в этом месте)	Качество чтения (в этом месте)
55516323	Замена	G - C	112	225.009
55523309	Делеция	CAAAAAAAAAAA - CAAAAAAAAAAAAA	Не указана	32.4684
238408404	Замена	G - T	1	7.79993

Всего 79 полиморфизмов, из них 7 инделей и 72 снп. Информация о трех полиморфизмах представлена в таблице выше. Для инделей, соответственно, глубина покрытия не указывается.

Команда	Что делает
convert2annovar.pl -format vcf4 chr2_snp.vcf > snp.avinput	Переводит .vcf в annovar, выводит snp.avinput
annotate_variation.pl -filter -out snp138_filtered -build hg19 -dbtype snp138 snp.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb.old/	Аннотация по dbSNP
annotate_variation.pl -out refgen -build hg19 snp.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb.old/	Аннотация по RefGene
annotate_variation.pl -filter -out 1000g -build hg19 -dbtype 1000g2014oct_all snp.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb.old/	Аннотация по 1000 Genomes
annotate_variation.pl -regionanno -out gwas -build hg19 -dbtype gwasCatalog snp.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb.old/	Аннотация по GWAS
annotate_variation.pl -filter -out clinvar -build hg19 -dbtype clinvar_20150629 snp.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb.old/	Аннотация по ClinVar

Качество и покрытие полиморфизмов:

	Медиана	Среднее
Качество	31,76	70,87
Глубина	3	15,76

Программа convert2annovar.pl показала, что замен 50 являются транзициями, а 22 трансверсиями.
Из refgene.variant_function видим, что снп были разделены на категории:
exonic (6)
intronic (57)
ncRNA_exonic (1)
UTR3 (6)
UTR5 (2)
Гены, в которые попали SNP: CCCDC88A, ATG16L1, MLPH. Из refgene.exonic_variant_function видим, что из 6 замен, которые попали в экзоны, колько одна синонимечная (в гене MLPH).
Всего 67 снп имеют rs (замены, которые есть в базе snp).
Была посчитана средняя частота найденных snp по аннотации по базе 1000 Genomes (37.72%).
Из клинической аннотации снп: одна из замен может вызвать Inflammatory Bowel Disease (воспаление кишнчника), аннотирована в clinvar.
Замены, аннотированные в Gwas: два полиморфизма ассоциируются с болезнью Крона, один - с раком простаты, еще один, не совсем понятно с чем, так как в графе обозначен как "Height".