Поиск и описание полиморфизмов у пациента

I.Подготовка чтений

1.Анализ качества чтений

На первом этапе был произведён анализ качества чтения с помощью программы FastQC. Как выглядела команда: fastqc chr14.fastq.

2.Очитска чтений

Далее с помощью программы Trimmomatic была произведена очистка чтения. Команда: java -jar /nfs/srv/databases/ngs/suvorova/trimmomatic/trimmomatic-0.30.jar SE -phred33 chr14.fastq chr14m.fastq TRAILING:20 MINLEN:50.

Затем снова с помощью прграммы FastQC был произведён анализ качества чтения, но уже файла chr14m.fastq.

_Результаты:

1. Изображения "Per base quality"

_ До чистки

_ После чистки

2. Число чтений

До чистки -8696

После чистки - 8562

3. Пояснения

Из приведённых изображений видно, что во втором случае наблюдается меньший разброс по квартилям. Были выкинуты короткие (до 50 нуклеотидов) риды, в которых могут считываться последовательности адаптеров, увеличивающих шум. Качество чтений стало заметно лучше после удаления последних нуклеотидов, имеющих низкое качество прочтения (меньше 20).

II.Картирование чтений

В данном задании было произведено картировние чтений с помощью программы Hisat2. Для начала необходимо было проиндексировать референсную последовательность. Команда: hisat2-build chr14.fasta chr14. Затем было произведено выравнивание прочтений и реферанса в формате .sam. Команда: hisat2 --no-spliced-alignment --no-softclip -x chr14 -U chr14m.fastq -S viravn.sam. После выполнения этой команды на экран вывелась информация о выравнивании, главным образом количество выравниваний различных прочений. Таким образом 21 прочтение не было выровнено вообще, 8539 прочтений выровнилось 1 раз и 2 прочтения выровнились >1 раза.

Следующим шагом стал анализ выравнивания. С помощью программы samtools был произведён перевод чтения с реферансом в бинарный формат. Команда: samtools view viravn.sam -b -o viravn.bam. Далее было отсортировано выравнивание чтений с референсом по координате в референсе начала чтения. Команда: samtools sort viravn.bam -T file.txt -o viravnotsort.bam. Затем отсортированный файл был проиндексирован. Команда: samtools index viravnotsort.bam.

III.Анализ SNP

Команды:

1_ samtools mpileup -uf chr14.fasta viravnotsort.bam -o sno.bcf

Функция: создание файла с полиморфизмами в формате .bcf

2_ bcftools call -cv sno.bcf -o sno.vcf

Функция: создание файла со списком отличий между референсом и чтениями в формате .vcf

3_ convert2annovar.pl -format vcf4 /nfs/srv/databases/ngs/skorpion7/sno.vcf>/nfs/srv/databases/ngs/skorpion7/snp.annov

Функция: создание файла, необходимого для работы программы annovar (индели были удалены вручную)

4_ annotate_variation.pl -out res.ref -build hg19 snp.annov /nfs/srv/databases/annovar/humandb.old

Функция: аннотация полученных snp по базе данных refgene

5_ annotate_variation.pl -filter -out res.snp -build hg19 -dbtype snp138 snp.annov /nfs/srv/databases/annovar/humandb.old

Функция: аннотация snp по базе данных dbsnp

6_ annotate_variation.pl -filter -dbtype 1000g2014oct_all -out res.gen -buildver hg19 snp.annov /nfs/srv/databases/annovar/humandb.old

Функция: аннотация snp по базе данных 1000 genomes

7_ annotate_variation.pl -regionanno -dbtype gwasCatalog -out res.gwas -build hg19 snp.annov /nfs/srv/databases/annovar/humandb.old

Функция: аннотация snp по базе данных Gwas

8_ annotate_variation.pl -filter -out res.clin -dbtype clinvar_20150629 -buildver hg19 snp.annov /nfs/srv/databases/annovar/humandb.old

Функция: аннотация snp по базе данных Clinvar

Полиморфизмы из файла .vcf

Координаты

Референсная последовательность

Чтения

Тип полиморфизма

Глубина покрытия

Качество чтений

21024619 A G Замена нуклеотида 37 221.999
81467864 CAT C Делеция 7 217.468
81449335 C G Замена нуклеотида 65 225.009

Всего был обнаружен 91 полиморфизм, из которых 3 являются инделями, остальные 88 - snp. Из трёх приведённых полиморфизмов хорошее качество только у последнего snp - 65. Качество у многих snp > 200, что является хорошим показателем.

Информация по аннотированным snp

Координата SNP Quality и DP refgene dbsnp 1000 genomes Gwas Clinvar
21024619 A G 221.999 37 exonic RNASE9 hom rs1243647 0.752995 Prostate cancer (gene x gene interaction)
21026773 C T 225.009 42 splicing RNASE9(NM_001110361:exon4:c.1+1G>
A,NM_001110358:exon3:c.1+1G>A) het 		rs891297 0.313698
81448224 C T 26.0194 3 intronic TSHR het rs74064786 0.0632987
81448282 C G 91.0145 5 intronic TSHR het rs3783950 0.515775
81448382 T G 148.134 6 intronic TSHR hom rs3783949 0.505591
81448782 T C 225.009 53 intronic TSHR het rs12590262 0.196486
81449335 C G 225.009 65 intronic TSHR het rs10139168 0.063099
81449534 T C 221.999 24 intronic TSHR hom rs3783947 0.432308
81449577 T G 225.009 32 intronic TSHR het rs3783946 0.195487
81449939 A G 212.009 21 intronic TSHR het rs11847808 0.063099
81450245 C T 77.0075 8 intronic TSHR het rs11850795 0.0632987
81450590 C T 40.0075 9 intronic TSHR het rs11850934 0.0632987
81450743 G A 225.009 26 intronic TSHR het rs2284723 0.186502
81450967 C T 12.272 8 intronic TSHR het rs74064794 0.0628994
81451009 G T 46.0072 18 intronic TSHR het rs74064795 0.00599042
81451052 C T 221.999 35 intronic TSHR hom rs12101255 0.415136
81451102 G A 225.009 51 intronic TSHR het rs74064796 0.227236
81451229 C T 221.999 71 intronic TSHR hom rs12101261 0.415335 Graves' disease
81451454 T C 3.54318 2 intronic TSHR het rs10140745 0.0632987
81451460 G A 6.19886 2 intronic TSHR het rs10151744 0.0638978
81451956 G A 222.003 11 intronic TSHR hom rs8003061 0.415136
81452172 G A 32.7667 2 intronic TSHR hom rs17111346 0.414936
81462283 T C 11.3429 1 intronic TSHR hom rs1023586 0.427516
81467335 A G 69.9724 3 intronic TSHR hom rs2268462 0.183906
81467450 A G 74.0075 10 intronic TSHR het rs2268463 0.183906
81467594 C A 105.008 7 intronic TSHR het rs2268464 0.183906
81467614 C G 106.008 9 intronic TSHR het rs2268465 0.17492
81467860 T C 156.008 1 intronic TSHR het
81468476 T C 11.3429 1 intronic TSHR hom rs58266067 0.361821
81468579 G A 9.52546 1 intronic TSHR hom rs58241131 0.356629
81470024 A G 50.0072 5 intronic TSHR het rs55960644 0.357628
81470054 T A 37.7652 2 intronic TSHR hom rs55957493 0.357628
81471277 C G 11.3429 1 intronic TSHR hom rs3783944 0.164736
81478781 G C 5.46383 1 intronic TSHR hom rs113158029
81490813 G A 9.52546 1 intronic TSHR hom rs146358415 0.0706869
81490842 T C 7.79993 1 intronic TSHR hom rs11159482 0.921925
81495039 C T 6.20226 1 intronic TSHR hom rs7161100 0.114217
81513417 C A 9.52546 1 intronic TSHR hom
81523495 C A 7.79993 1 intronic TSHR hom
81528412 T A 221.999 27 intronic TSHR hom rs17111401 0.327676
81549595 G A 11.3429 1 intronic TSHR hom rs8019570 0.26238
81557279 G T 38.7651 2 intronic TSHR hom rs10147011 0.286542
81558640 C G 10.4247 1 intronic TSHR hom rs2075175 0.29972
81558806 C T 221.999 61 intronic TSHR hom rs2075176 0.29972
81558965 A G 221.999 70 intronic TSHR hom rs2241119 0.29972
81561425 G A 4.13164 1 intronic TSHR het rs10142999 0.30012
81562808 A G 5.46383 1 intronic TSHR hom rs2075178 0.30012
81562998 T C 222.791 18 exonic TSHR hom rs2075179 0.30012
81566846 C T 11.3429 1 intronic TSHR hom
81574283 T A 6.98265 1 intronic TSHR hom rs11845715 0.833666
102258329 C T 9.52546 1 intronic PPP2R5C hom
102298202 T C 221.999 57 intronic PPP2R5C hom rs10152015 0.057508
102314040 G A 3.01618 1 intronic PPP2R5C het rs4589480 0.136182
102314069 A G 7.79993 1 intronic PPP2R5C hom rs1678003 0.241014
102321657 A G 42.7648 2 intronic PPP2R5C hom rs1746588 0.168131
102329228 C G 5.46383 1 intronic PPP2R5C hom rs1746585 0.165935
102333854 C T 10.4247 1 intronic PPP2R5C hom rs111453025 0.0563099
102334091 A G 8.64911 1 intronic PPP2R5C hom rs2476516 0.373802
102346180 G A 6.20226 1 intronic PPP2R5C hom rs2749908 0.401558
102348268 G A 161.003 11 intronic PPP2R5C hom rs1741157 0.377796
102348274 T C 158 13 intronic PPP2R5C hom rs1741158 0.247204
102348358 A G 186.999 32 intronic PPP2R5C hom rs1677990 0.237021
102349540 C T 158.012 22 intronic PPP2R5C hom rs1741125 0.376997
102349542 G T 158.009 22 intronic PPP2R5C hom rs1741126 0.376997
102349907 A G 221.999 81 intronic PPP2R5C hom rs2720207 0.378395
102351646 T C 6.20226 1 intronic PPP2R5C hom rs7140798
102351705 G C 3.56185 2 intronic PPP2R5C het rs60265551 0.147963
102353323 C T 8.64911 1 intronic PPP2R5C hom
102356475 C T 221.999 47 intronic PPP2R5C hom rs1904298 0.128794
102359164 G C 162 14 intronic PPP2R5C hom rs2720221 0.38139
102359304 A G 219.009 35 intronic PPP2R5C het rs2720220 0.133387
102359489 A G 221.999 37 intronic PPP2R5C hom rs2720219 0.305711
102359568 A G 104.008 15 intronic PPP2R5C het rs2749902 0.133786
102360745 T C 225.009 46 intronic PPP2R5C het rs7142002 0.112819 Autism
102360916 G A 148.008 46 intronic PPP2R5C het rs2251246 0.196086
102361064 A C 24.0241 5 intronic PPP2R5C het rs7145448 0.109026
102361134 G A 11.3429 1 intronic PPP2R5C hom rs7145940 0.123403
102361400 C T 38.7651 2 intronic PPP2R5C hom rs1741134 0.341853
102361737 G A 10.4247 1 intronic PPP2R5C hom rs59070929 0.11262
102364006 G C 6.98265 1 intronic PPP2R5C hom rs8005273 0.134784
102369553 G A 3.01618 1 intronic PPP2R5C het rs1678035 0.381789
102375658 T C 37.0187 4 intronic PPP2R5C het rs1616161 0.170527
102376212 G T 84.0932 7 intronic PPP2R5C het rs1612684 0.354034
102379870 T C 11.3429 1 intronic PPP2R5C hom rs6575883 0.150759
102383175 G A 38.7651 2 intronic PPP2R5C hom rs60089041 0.174521
102391577 G C 221.999 23 exonic PPP2R5C hom rs3742424 0.176717
102392060 G A 125.008 24 UTR3 PPP2R5C(NM_001161726:c.*451G>A,NM_001161725:c.*451G>
A,NM_002719:c.*451G>A,NM_178586:c.*451G>A) het 		rs11553289 0.0297524

Как видно из таблицы, rs имеют 82 snp. Из столбца 1000 genomes видно разнообразие частот олиморфизмов - от 0,005 до 0,833. snp попали в гены RNASE9 (2 snp), TSHR (48 snp), PPP2R5C (38 snp). Clinvar отфильтровал все snp. Остальные данные приведены в таблице.

© Иззи Антон,2018