Практикум 3

Все задания этого практикума выполнялись для модели с PDB ID 6XLR. Эта запись соответствует структуре галактозооксидазы — мономерного фермента, осуществляющего реакцию окисления галактозы молекулярным кслородом. Данный белок секретируется некоторыми грибами во внеклеточное пространство, где образующийся в результате его работы пероксид водорода предположительно выполняет бактериостатическую функцию [1]. В соответствии с более высоким окислительо-восстановительным потенциалом экстраклеточной среды фермент содержит в своей структуре несколько дисульфидных мостиков [2].

Задание 1

Наличие у изучаемого белка альтернативных конформаций можно продемонстрировать на примере дисульфидного мостика, образуемого остатками цистеина 18 и 27. Каждый из них может принимать две альтернативные конформации, отличающиеся главным образом направлением поворота боковой цепи (Рис. 1). При этом не все сочетания этих форм являются термодинамически "выгодными" (если принять наличие дисульфидного мостика между двумя остатками). Наибольшие отклонение от ожидаемой геометрии химических связей наблюдаются для сочетания, в котором цистеин 18 имеет конформацию B, а цистеин 27 - конформацию A. В этой форме углы X-S-Y составляли бы 65.3° и 75.6° (около 90° для сероводорода), а связь S-S имела бы длину 3.6 Å (примерно 2 Å в дисульфидах).

**Рис. 1.** Разные сочетания альтернативных конформаций двух остатков цистеина в структуре галактозооксидазы.

Скрипт для задания 1

Сессия pymol для задания 1

Задание 2

Для всей белковой глобулы была выставлена градиентная окраска по значению B-фактора (Рис. 2). Разные части структуры окрасились в разные цвета: синий цвет имеет ядро глобулы и участки с выраженной вторичной структурой, тогда как неструктурированные петли на поверхности белка и свободные концы полипептидной цепи окрасились в белый цвет или в различные оттенки красного.

B-фактор отражает "размытие" восстановленой по экспериментальным данным электронной плотности. Это соответствует сделанным наблюдениям: в данном примере повышенная подвижность некоторых поверхностных участков цепи, не удерживаемых большим количеством взаимодействий, приводит к неточности при определении их положения в структуре белка.

**Рис. 2.** Остав молекулы галактозооксидазы, тип отображения "stick". Градиент от синего к карсному с увеличением значения B-фактора.

Для более точной демонстрации этого эффекта можно визуализировать распределение электронной плотности для одного остатка, разные атомы которого сильно отличаются по значению B-фактора. Таков, например, остаток аргинина 160 (Рис. 3).

**Рис. 3.** Электронная плотность для атомов остава белка и боковой цепи аргинина 160 при уровнях подрезки 1, 2 и 3. Градиентная окраска по B-фактору.

Уже при уровне подрезки 1 один из атомов азота в боковой цепи аргинина не покрыт сеткой, отражающей положение граничных поверхностей электронных облаков. Именно этот атом имеет наибольшее значение B-фактора. При увеличении уровня подрезки электронную плотность теряют и другие атомы с большим B-фактором. Можно заключить, что боковая цепь данного остатка аргинина в молекуле галактозооксидазы обладает высокой степенью подвижности. Вследствие этого в различных молекулах в составе кристалла ее положение несколько различается, и реконструированное распределение электронной плотности оказывается искусственно "сплющенным" и уширенным.

Скрипт для задания 2

Сессия pymol для Рис. 2

Сессия pymol для Рис. 3

Задание 3

В данном задании была рассмотрена структура кристалла галактозооксидазы, использованного в рентгеновском эксперименте (Рис. 4, 5). Для отображения соседних молекул была использована следующая команда:

symexp sym, 6xlr, 6xlr, 3

Путем использования этой команды для разных копий объекта и удаления лишних соседей были получены изображения, отражающие структуру кристалла, использованного в эксперименте (Рис. 4). Можно заметить, что в нем присутствует всего 2 типа молекул галактозооксидазы с различной ориентацией глобулы.

**Рис. 4.** Периодичность в структуре кристалла галактозооксидазы.

С помощью той же команды было также получено изображение для соседних молекул галактозооксидазы, непосредственно контактирующих с исходной (Рис. 5). По нему видно, что у каждой белковой глобулы в составе кристалла есть 8 соседей.

**Рис. 5.** Молекула галактозооксидазы и ее непосредственные соседи в кристалле.

Сессия pymol для задания 3

Источники

Whittaker J. W. (2002). Galactose oxidase. Advances in protein chemistry, 60, 1–49.
Kelly-Falcoz F., Greenberg H., Horecker B. L. (1965) Galactose Oxidase. Journal of Biological Chemistry, 240(7), 2966-2970.