Анализ крупных перестроек геномов

Выравнивание геномов

Для выравнивания были выбраны представители рода Brucella, а именно вторые хромосомы Brucella canis ATCC 23365, Brucella melitensis biovar Abortus 2308 и Brucella pinnipedialis strain 6/566.
Ниже представлены dot-matrix выравниваний, построенных с помощью blast, с параметрами E-value=0.01, длина слова = 256. Как вы можете наблюдать, картинки получаются чёткими, характерными, без шумов и с достаточно интересным содержанием, так что качество оправдывает такую большую длину. По горизонтали на графике представлена Brucella canis, по вертикали - melitensis и pinnipedialis соответственно.Так же было дополнительно построено выравнивание pinnipedialis относительно melitensis(по горизонтали Рисунок 3).

Рисунок 1. Brucella canis/Brucella melitensis
Cсылка на выравненные последовательности Рисунок 2. Brucella canis/Brucella pinnipedialis
Cсылка на выравненные последовательности

Рисунок 3. Brucella meltensis/Brucella pinnipedialis
Cсылка на выравненные последовательности

Идентифицируя карты выравнивния, можно сказать, что:

В хромосоме B.m. относительно В.с. произошла инверсия центрального участка хромосомы, плюс крохотные локальные делеции в районе с 340К по 420К.
В хромосоме B.p. относительно B.c. произошла инверсия двух крупных участков и одна небольная делеция участка, соответствующего 340К-360К для B.c. На самом деле, если изобразить эти инверсии, будет видно, что порядок участков не изменился, то есть, по факту, хромосомы идентичны.
В хромосоме B.p. относительно B.m. произошли, очевидным образом суммируя предыдущие два вывода, три перестановки: можно предположить, что последовательно шли сначала инверсия центрального участка, а после две инверсии двух боковых.
Это внешне детектируется на карте как две транслокации или транслокация и инверсия. .
Что любопытно, заметных делеций практически не наблюдается, что говорит, скорее, о наличии вставок в наиболее длинный геном B.c.

Сходство и покрытие

В принипе, в каком-то виде мы получили эти данные раньше, ещё со страницы blast, идентичность и покрытие значатся в колонках Ident и Cover соотвественно:

Рисунок 4A. Brucella canis/Brucella melitensis Рисунок 4B. Brucella canis/Brucella pinnipedialis Рисунок 4C. Brucella melitensis/Brucella pinnipedialis

Однако, если проанализировать последовательности в программе NGE, то мы получим более детальную картинку:
Исходный файл с которым работала программа: genomes.tsv
Алгоритм выполнения программ:

npge -g npge.conf
npge Prepare
npge Examine
Коррекция параметров WORKERS, MIN_IDENTITY в npge.conf в соответствии с examine/identity_recommended.txt
WORKERS = 1 для kodomo; MIN_IDENTITY = 0.896
npge MakePangenome - log
pangenome/pangenome.bs
npge PostProcessing
qnpge - визуализация

На основе выдачи данного алгоритма, была сконструирована нижележащая таблица. Для удобства сравнения, в таблицу занесено среднее значение идентичности для каждого типа блоков. Помимо этого, в графах таблица представлено количество фрагментов в блоке (Number), покрытие фрагментов (Fragment cover) суммарная длина блоков и покрытие (Cover).

Blocks: all non-minor
at least 2 fragm. Exact stem
s-blocks Partial
h-blocks With repeats
r-blocks Rest
1 fragm, not minor Minor
very short m-blocks

Number of fragments 96 61 15 20 8 27

Fragment cover 3533831/99.38% 3423033/96.26% 79819/2.24% 30979/0.87% 21176/0.59% 737/0.02%

Ident(median) 0.9961 0.9968 0.9986 0.9345 not shown 1

Cover 1185966/98.19% 1141866/95.54% 39940/3.3% 4160/0.34% 21176/1.75% 631/0.05%

Таблица 1. Сходство и покрытие по NPG

Общая длина послеовательностей:3555744 б.п
Покрытие всех блоков считалось по формуле: Blocks' lengths: unique + regular = 21647 + 1186126 = 1207773(33.97%)
Таким образом, покрытие блоков не_уникальных, составляет 33.35%

Крупные перестройки

Синтетии

Рассмотрим синтетии, используя данные сконструированных файлов blocks.blocks и blocks.gbi. Глобальные блоки состоят из последовательно идущих во всех геномах s-блоков, перемежающихся блоками других типов.
NPG насчитал 8 глобальных блоков, схему их расположения можно наблюдать ниже.

-BRUCA g3x215380< i2x4> g3x462955> g3x136< g3x61625> g3x2143< i2x4n1< g3x69512> g3x175425> g3x225226<

+BRUMM g3x225226> i1x3> g3x462955> g3x136> g3x61625> g3x2143> i1x4> g3x69512> g3x175425> g3x215380>

-BRUPB g3x175425> g3x225226< g3x215380< i2x4> g3x462955> g3x136< g3x61625> g3x2143< i2x4n1< g3x69512>

conservative g3x462955> g3x61625> g3x69512>

Рисунок 5 Схема расположения g-блоков

Все глобальные блоки состоят из трёх фрагментов, средняя длина фрагментов варьируется в пределах от 136 п.н до 460840.33 п.н.

B.can-s -- всего 10 блоков, из которых 8 глобальных
B.mel-s -- всего 9 блоков, из которых 8 глобальных
B.pin-s -- всего 10 блоков, из которых 8 глобальных

Инвертированных блоков наблюдается 4, по два из 1 и 2 фрагментов, длиной в 3-4 нуклеотида,

Делеции

H-блоки или Partial - "полустабильные" блоки собравшие по одному фрагменту из части геномов и u-блоки - уникальные последовательности из одного генома без гомологов среди других геномов, представляют из себя маркёы вставок/делеций, которые мы наблюдали на dot-matrix blast'a.

BLOCKS BRUCA BRUPB BRUMM

h2x25169 1 1 0

h2x5242 1 1 0

h2x2881 1 0 1

h2x2017 1 1 0

h2x886 1 1 0

h2x837 1 1 0

h2x658 0 1 1

h2x414 1 0 1

h2x362 0 1 1

h2x329 1 0 1

h2x285 1 1 0

h2x276 1 1 0

h2x263 1 0 1

h2x189 1 1 0

h2x132 1 1 0

u1x18085 1 0 0

u1x1904 0 0 1

u1x353 1 0 0

u1x310 0 0 1

u1x164 0 0 1

u1x150 1 0 0

u1x108 0 1 0

u1x102 0 1 0

Таблица 2. H и U блоки

Partial-блоки совпадают в Brucella canis совпадений Brucella melitensis к Brucella pinnipedialis с разницей восемь к трём. Столько и наблюдается делеций/вставок, вне учёта уникальных последовательностей.
Гены, присутствующие в уникальных последовательностях полностью я рассматривать не буду, укажу самые большие для каждой последовательности:

BRUCA_343559_361643 block=u1x18085 - сборная солянка из гипотетических белков и
- /product="GMP synthase, C-terminal domain"
- /product="P-type conjugative transfer protein TrbL"
- /product="P-type conjugative transfer protein TrbJ"
- /product="TraC"
- /product="TraJ protein"
- /product="traI protein"
- /product="addiction module antitoxin, RelB/DinJ family"
BRUPB_778560_778667 block=u1x108 - product="septum site-determining protein MinD"/protein_id="AIJ72213.1"
BRUMM_157287_159190 block=u1x1904 - /locus_tag="BAB2_0167"/pseudo - псевдоген.

Остальные гены представлены hypothetical protein - то есть предсказаны, но не аннотированы, их функция не раскрыта. Вышеперечисленные - скорее уникальные белки, они не обладают какой-то общей функцией, в том плане, что вполне логично, что они оказались в уникальных последовательностях.

Ошибки аннотации гена и прочие расхождения

Сначала хотелось бы ответить, опираясь на удобные визуальные данные NPG:
В некоторых блоках присутствуют гипотетические белки, хотя аналоги их не определены в других геномах:

Рисунок 6A О-сукцинил-трансфераза в B.canis, Гликозид-гидролаза в B.mel-s, неопределённый ген/белок в последнем блоке от B.pin-s

Рисунок 6B Несоответствия в аннотациях участка BRUCA и BRUMM(B.canis и B.mel-s)

Рисунок 6C Несоответствия в аннотациях на NCBI

Фиолетовые блоки, кстати, представляют собой перекрытия.

Теперь обратимся к множественным совпадениям - здесь указанный гипотетический белок представляет собой вполне определённые аналоги в других блоках (в большинcтве своём это экстрацеллюлярные связывающие белки, у B.pinnipedialis так же присутствует белок внутренней связывающе-зависимой транспортной системы).

Рисунок 7A,B