Поиск сайтов связывания транскрипционного фактора через программу МЕМЕ

В рамках данной работы с помощью программы МЕМЕ, установленной на kodomo, был проведён поиск сайта связывания транскрипционного фактора, регулирующего синтез пуринов у одной из гаммапротеобактерий из прошлого практикума. Была рассмотрена бактерия Haemophilus influenzae

Работа с базой данных Uniprot

Был составлен запрос:

keyword:"purine biosynthesis" organism:"haemophilus influenzae"

По результатам поиска было найдено 295 находки, 261 из которых значились в секции 'Unreviewed', и только 34 под гиперссылкой "Reviewed" подходили для дальнейего этапа работы. Среди популярных организмов значились мнемоники HAEIN (16), HAEI8 (16), HAEIE (6), HAEIG (15), HAEI1 (16), в скобках - количество записей Swiss-Prot, аннотированных как необходимые нам. Выбран был первый штамм, информацию, касающуюся данной находки со страницы Uniprot, смотрите в таблице ниже:

Таблица 1. Информация о выбранном штамме

Uniprot-мнемоника Наименование штамма

HAEIN Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) [71421]

Далее из 16 белков были отобраны нижележащие девять, первыми найденные в записи полного генома, список выбранных белков представлен в выдаче Uniprot, столбцы слева направо - идентификатор записи, мнемоника UniprotKB, отметка reviewed, имя белка, имя гена, организм - во всех случаях один, и длина:

Рисунок 1 Иллюстрация подходящей выдачи с сайта Uniprot

Поиск мотивов через ememe

Для каждого из генов выбранных белков в скачанной записи EMBL AC L42023.1были записаны координаты Upstream-региона из 100 нуклеотидов поиском в EMBL необходимой части - по координатам из файла EMBL.

Таблица 2. Информация о генах апстримов.

Идентификатор Мнемоника Ген Координаты гена Координаты апстрима

P45283 PURA_HAEIN purA 1695071..1696369 1694971-1695070

P43847 PUR4_HAEIN purL 812967..816929 812867-812966

P44334 IMDH_HAEIN guaB 248948..250414 248848-248947

P44313 FOLD_HAEIN folD 640075..640923 639975-640074

P43854 PUR1_HAEIN purF 1273386..1274903 1273286-1273385

P43850 PURK_HAEIN purK 1683529..1684617 1683429-1683528

P44335 GUAA_HAEIN guaA 251125..252696 251025-251124

P43845 PUR2_HAEIN purD 941550..942839 941450-941549

P44797 PUR8_HAEIN purB 680324..681694 680224-680323

Все апстрим последовательности были сохранены в файле al.fasta Программа, запущенная далее на сервере kodomo:

ememe -dataset all.fasta -outd align = 'center' ir pr4 -nmotifs 3 -revcomp Y

Выдача той была сохранена в папке pr4, которая, в том числе, содержит html-страницу выдачи meme

Результаты

Таблица 3. Три мотива из выдачи html

В таблице 3 так же можно наглядно проналюдать распределение по цепям.
Из-за столь малой выборки, мотивы, покрывающие 8/9 и 7/9(третий) последовательностей можно считать консервативными.

Таблица 4. LOGO's

Logo первого мотива	Logo второго мотива	Logo третьего мотива

Ниже вы можете видеть обощённые данные выдачи по находкам, в данном случае, нас интересует завышенные значения E-value, которые свидетельствуют о наших мотивах, как о не очень подходящих.

MOTIF 1 width = 9 sites = 8 llr = 75 E-value = 7.2e-001
MOTIF 2 width = 8 sites = 8 llr = 64 E-value = 7.9e+002
MOTIF 3 width = 11 sites = 7 llr = 70 E-value = 8.7e+002

Во всех последовательностях так или иначе представлены мотивы, но присутствует в каждой суммарно от одного до трёх:

fold, purA, purB, purF, purL, guaA - 3 раза
purK, purD - 2 раза
guaB - 1 раз

Помимо этого, программа в поле "SUMMARY OF MOTIFS" выдала общее расположение мотивов по цепям - то, о чём мы говорили выше.

Рисунок 2. Расположения описанных в Таблице 3 сайтов по цепям нитей ДНК

Сравнение с LOGO сайта связывания пуринового рецептора purR E.coli

Для данного сравнения в базе Uniprot был найден идентификатор пуринового репрессора E.coli PURR_ECOLI гена PurA. На сайте NCBI было найдено несколько подходящих статей про регулоны PurR:

Ожидаемо, мотивы из данных статей в сравнении с нашими не оправдали себя, так как найденные нами мотивы короче, к тому же, паттерны их даже частично не совпадают с паттернами описанных в статьях участков. Для сравнения привожу картинки:

Таблица 5. LOGO из статей

LOGO из первой статьи	LOGO из второй статьи

Анализ мотивов с помощью программы emast

Далее был проведён поиск подходящих мотивов с помощью программы emast, установленной на kodomo. Для достижения успеха значения e-value для мотивов сразу были выставлены не превышающими "хорошего" 0,001:

solera@kodomo:~/public_html/term4/pr4$ emast -mfile pr4/meme.txt
Warning: File /usr/share/EMBOSS/acd/emast.acd line 163: Qualifier 'b' matches start of known 'bfile'
Warning: File /usr/share/EMBOSS/acd/emast.acd line 163: Qualifier 'b' matches start of known 'best'
Warning: File /usr/share/EMBOSS/acd/emast.acd line 163: Qualifier 'b' matches start of known 'brief'
Warning: File /usr/share/EMBOSS/acd/emast.acd line 199: Qualifier 'c' matches start of known 'comp'
Warning: File /usr/share/EMBOSS/acd/emast.acd line 218: Qualifier 'w' matches start of known 'warning'
Warning: File /usr/share/EMBOSS/acd/emast.acd line 232: Qualifier 'mf' matches start of known 'mfile'
Warning: File /usr/share/EMBOSS/acd/emast.acd line 239: Qualifier 'df' matches start of known 'dfile'
Warning: File /usr/share/EMBOSS/acd/emast.acd line 259: Qualifier 'm' matches start of known 'mfile'
Warning: File /usr/share/EMBOSS/acd/emast.acd line 259: Qualifier 'm' matches start of known 'mt'
Warning: File /usr/share/EMBOSS/acd/emast.acd line 259: Qualifier 'm' matches start of known 'mf'
Warning: File /usr/share/EMBOSS/acd/emast.acd line 259: Qualifier 'm' matches start of known 'minseqs'
Warning: File /usr/share/EMBOSS/acd/emast.acd line 259: Qualifier 'm' matches start of known 'mev'
Motif detection
Print results for sequences with E-value [10]: 0.001
Show motif matches with p-value < mt [0.0001]:
MAST program output file [meme.emast]: emast.html

Рисунок 3 Найденные emast мотивы.

Программа обнаружила меньшее количество мотивов, но все они присутствуют в наших upstream регионах и определены emast, как достоверно-хорошие. С полной выдачей emast можно ознакомиться по этой ссылке. Особое внимание предлагаю обратить на параграф SECTION III: ANNOTATED SEQUENCES. В том представлены последовательности изображённых на Рисунке 3 мотивы с p-value находок и поштучным присутствием необходимых нуклеотидов в мотиве.