Особенности мембранных белков

Задание 0

Для трех трансмембранных бета-баррелей и трех трансмембранных альфа-спиральных белков определим параметры. Опишем в табл. 1.

Таблица 1. Описание трансмембранных белков с известной 3D структурой. При подсчете медианы числа остатков использовался тот остаточк, который погружен в мембрану

PDB код	Тип (спираль, баррель)	Какая мембрана (внутренняя или внешняя, организм, органелла)	Толщина гидрофобной части мембраны в ангстремах	Медиана числа остатков в одном трансмембранном участке
3PIK	баррель	Внешняя мембрана Escherichia coli	24.3 ± 1.2	12.5
1BXW	баррель	внешняя клеточная мембрана E.Coli	25.4 ± 1.9	9.5
3GP6	баррель	Плазматическая мембрана Escherichia coli	24.7 ± 1.5	10
2GFP	спираль	Мембрана эндоплазматического ретикулума Homo sapiens	29.4 ± 1.1	22
3BEH	спираль	Внутренняя клеточная мембрана Rhizobium loti	30.6 ± 0.8	24
2BS2	спираль	Внутренняя мембрана аэробных бактерий	31.8 ± 0.8	23

Задание 1: отбор гомологов

Для изучения особенностей мембранных белков был взят белок 3PUV. Изображение с ним можно увидеть на рис. 1.

Рис. 1. Изображение белка 3PUV

Для этого белка отберем его гомологи. Для этого в программе blastp, в качестве исходной последовательности используем белок 3PUV (MALG_ECOLI). Указываем максимальное количество хитов (max target hits) равное 500, исключим белки из того же филума (в поле Organism введем название филума E.coli - Proteobacteria и поставим галочку напротив "Exclude"). E-value у самой худшей находки 4e-39. Вы можете посмотреть: файл с именами выбранных белков, файл с их последовательностями.

Задание 2: анализ структуры выданного белка

В базе данных OPM находим белок 3PUV (см. рис. 1), и заполняем про него таблицу:

PDB ID	Организм	Тип мембраны	TC-код	Угол наклона спиралей к нормали	Количество трансмембранных спиралей
3PUV/2R6G	Escherichia coli	внешняя бактрериальная мембрана	3.A.1.1.1	разный, в среднем 20-30 градусов	14 (в E и G цепи)

Описание TC-ID:

3: Primary Active Transporters - основные активные транспортеры

3.A: P-P-bond-hydrolysis-driven transporters - транспортеры связанные с гидролизом Р-Р связи

3.A.1: The ATP-binding Cassette (ABC) Superfamily - АТФ-связывающая касета (ABC) надсемейство

3.A.1.1: The Phage Infection Protein (PIP) Family all uptake system; the Carbohydrate Uptake Transporter-1 (CUT1) Family - белок связанный с инфекцией, семество всех белков захвата вируса; переносчики карбонильной группы

3.A.1.1.1: порядковый номер

	В общем случае ТС-код V.W.X.Y.Z  расшифровывается так:
		-V (число) соответствует классу транспортера (то есть, канал, переносчик, работающий отдельно или связанный в цепь) 
		-W (БУКВА) соответствует подклассу транспортера, который в случае первичных активных переносчиков относится к источнику энергии,
		используемому для управления транспортом 
		-X (число) соответствует семейству транспортера (иногда на самом деле надсемейства) 
		-Y (число) соответствует подсемейству 
		-Z соответствует субстрату или набору транспортируемых субстратов

Задание 3: анализ множественного выравнивания трансмембранных белков

Построим множественное выравнивание отобранных гомологов с помощью программы Muscle. И добавим к нему две новые строки анотации: TM_PREDICTED - участки предсказанные программмой TMHMM для белка-гомолога (Bacillus vireti-WP_024026335.1) и TM_REAL - спирали иследуемого белка (рис. 2). И получили изображение 3.

Рис. 2. Изображение белка 3PUV с раскрашенными по выравниванию аминокислотами.

Рис. 3. Изображение выравнивания белка 3PUV с его гомологами. Выравнивание раскрашено по гидрофобности (стандарт: A, L, I, V, M, F - красные, N, R, K, P, Q, S, Y - синие) с указанной консервативностью 25.

Консервативны ли в вашем белке участки, относящиеся к трансмембранным спиралям, и какие аминокислотные остатки встречаются чаще в спиралях? Достаточно консервативны (рис. 3), чаще всего встречаются глицин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, валин, серин (треонин, что логично, т.к. они имеют близкое строение), аргинин, глутамин, т.е. в основном гидрофобные аминокислоты включены в трансмембранные спирали.

Консервативны ли участки между спиралями (или, если спираль только одна - цитоплазматический участок)? Да, весьма консерватины, причем в некоторых случаях даже более консервативны, чем сами спирали.

Есть ли в трансмембранных спиралях вашего белка консервативные заряженные или просто полярные остатки? Если да, то как бы вы объяснили их присутствие? Есть, но их очень мало. Так, например, пару раз встречается пролин, что связано с поворотами спирали в этих места, а также аспарагин и аспарагиновая кислота встретились по разу, что имеет какое-то значение, предположительно связанное с функцией мальтозного транспортера.

Лишних спиралей программа TMHMM не нашла, но зато одну не увидела. Поскольку они довольно короткие, то скорее всего эти спирали у белка-гомолога целиком или частично просто заменены на петли, т.к. они, судя по всему, особой роли не играют в формировании структуры. И в целом создалось впечатление, что у Bacillus vireti гомологичный белок компакнее.

Дополнительные задания

Первое. Зная, что размеры клетки E.coli 0,4—0,8 х 1—3 мкм, возьмем среднюю клетку размером 0.6 x 3 мкм, если бы она была шарообразной, то это где-то 1.7 мкм, толщина мембраны 40А = 0.0004 мкм. Предствим, что наша клетка стала размером с дыню, допустим, что эта дыня 25 см, тогда размер мембраны у такой увеличенной клетки будет равен приблизительно 589 мкм, что в 6 раз больше средней толщины человеческого волоса (80-110 мкм) и в 84 раза больше диаметра эритроцита (7 мкм).

Второе. Проверим правило "positive inside" для белка 3PUV и его гомологов. Правило заключается в том, что часть белка, расположенная с n-стороны от мембраны содержит больше положительно заряженных остатков (Lys, Arg, His). Для этого посмотрим на рисунок 3, структуру моего белка в JMol и воспользуемся результатами предсказания программмы TMHMM. И действитльно, правило выполняется, на n-стороне больше положительных остатков, когда как на p-стороне их почти нет.

Третье. Проверим, что остатки бета-барреля 2JK4, обращенные в мембрану, гидрофобны. Для этого воспользуемся сервером SheeP и получим карту, на которой красным выделены аминокислотные остатки, у которых боковые цепи направлены наружу, а желтым - внутрь (рис. 4). Затем выделим в JMol направленные наружу (в фосфобилипидный слой) остатки (рис. 5). Как видно из изображения 6 смотрят наружу цепи у неполяных аминокислот в основном, хотя и есть полярные, но они находятся ближе к одной из сторон мембраны, большая часть образуют перегибы.

Рис. 4. Результат работы программы SheeP.


Рис. 5. Изображение белка 2JK4 с выделенными красным остатками с боковыми цепями смотрящими наружу.	Рис. 6. Изображение белка 2JK4 с выделенными синим полярными остатками с боковыми цепями смотрящими наружу.

Источники информации:

Сервер kodomo ФББ МГУ им. Ломоносова