Мини-обзор генома и протеома Sphingomonas melonis

Введение

Sphingomonas melonis — грамотрицательная лишённая жгутиков бактерия, относящаяся к типу Proteobacteria. Известна как фитопатоген, вызывающий появление бурых пятен на плодах дыни (Cucumis melo var. inodorus), из которых и была впервые выделена и описана в 2002 году. Длина генома S. melonis составляет около 3,65 Mbp (миллионов пар нуклеотидов), из которых ~ 65% — Г+Ц пары (мольная доля) [1]. Помимо сельскохозяйственного значения бактерия интересна тем, что способна разлагать никотин, используя его в качестве единственного источника углерода, азота и энергии [4], а также метаболизировать иные потенциально опасные для человека и окружающей среды вещества, например, имидаклоприд и метомил (широко применяемые в сельском хозяйстве инсектициды) [2], [3]. Таким образом, изучение данного вида может оказаться полезным для сельского хозяйства как с точки зрения предотвращения ущерба, наносимого S. melonis урожаю, так и с точки зрения биоремедиации ядовитых веществ, применяемых для обработки агрикультур.

Материалы и методы

1) Файлы, содержащие геномы, кодирующие последовательности и расшифрованные кодирующие последовательности, а также таблица особенностей генома скачаны с интернет сайта NCBI.

2) Данные по содержанию различных нуклеотидов, длине геномов и GC-составу получены при помощи программы “скрипт1” из сопроводительных материалов, написанной на python в сервисе Google Colab.

3) Данные для построения графиков GC-skew получены при помощи программы “скрипт2” из сопроводительных материалов, написанной на python в сервисе Google Colab, и обработаны в сервисе Google sheets при помощи функции построения диаграмм. В качестве параметров “window” и “step” программы были выбраны числа 100000 и 1000 соответственно.

4) Для поиска последовательностей потенциальных шпилек использована программа “скрипт3” из из сопроводительных материалов, написанная на python в сервисе Google Colab. В качестве параметров “lencompl” и “lengap” программы были выбраны числа 15 и (от 3 до 12) соответственно.

5) Для построения графиков распределения длин белков, позиции шпилек, позиций начала последовательностей тРНК и других графиков, не касающихся вторичной структуры полимеров, использованы встроенные функции сервиса Google sheets.

6) Для поиска оптимальной вторичной структуры шпилек и тРНК использованы интернет сервисы: rna.urmc.rochester.edu и RNAWebSuite соответственно.

7) Поиск антикодона по вторичной структуре мы проводили по следующему алгоритму: Определяли антикодоновую шпильку (противолежит свободным концам НК, в случае наличия двух противолежащих выбирали большую) Находили в петле антикодоновой шпильки три нуклеотида, равноудалённых от конца петли (начала стебля шпильки) Если п1 или п2 не могли быть выполнены, относили структуру к неоднозначно трактуемым

8) Количества кодонов для каждой из аминокислот и количества старт-кодонов получены при помощи программы “скрипт4” из сопроводительных материалов, написанной на python в сервисе Google Colab

Результаты

Основные характеристики генома в сравнении с видами того же рода: S. alpina, S. saxanigenens, S. panacis.

В таблице 1 приведены базовые численные характеристики геномов перечисленных выше видов:

По данным таблицы видно, что наименьший процент GC-пар в геноме характерен для S. alpina, бактерии-психрофила [5]. Для всех видов количество аденинов очень близко (различия колеблются в пределах 1%), как и количество цитозинов и гуанинов, что говорит о практически одинаковом нуклеотидном составе на “+” и “-” -цепях. Длина генома S. melonis оказалась заметно меньше длины геномов других видов (~72,8% от общего среднего).

На рисунке 1 показаны графики GC-skew для четырёх видов. По ним можно приблизительно понять, где находится ориджин и точка терминации репликации (минимумы и максимумы на графиках соответственно). По рисунку видно, что даже в пределах рода форма графика GC-skew может значительно меняться.

Вторичная структура: шпильки и тРНК.

Под потенциальной шпилькой мы подразумеваем такой участок цепи нуклеиновой кислоты, который может “склеить” своё начало и конец посредством образования водородных связей между комплементарными парами нуклеотидов.

В геноме S. melonis найдено 18 различных потенциальных шпилек по заданным параметрам. Судя по рисунку 2, они распределены по геному более-менее равномерно:

Из них мы проанализировали произвольные 3. Результаты отражены на рисунке 3:

Все три последовательности не входят целиком ни в одну из кодирующих последовательностей генома, а лежат между ними, частично заходя в начала и концы.

Для ещё одной последовательности мы также построили структуру, однако по ходу построения выяснилось, что она захватывает больший участок генома и включает в себя найденную нами по с помощью кода:

В геноме S. melonis найдено 50 тРНК. Из них по 25 расположены на “+” и “-” цепях. Рисунок 5 показывает их распределение по геному (мы брали координаты начала вне зависимости от цепи, поскольку длина последовательности тРНК не превышает 100 нуклеотидов, что пренебрежимо мало в сравнении с длиной генома):

Для первых 10 (первых) из 50 последовательностей мы построили гипотетическую вторичную структуру, определили антикодон и соответствующую ему аминокислоту и сравнили её с реальной (из описания последовательностей в файле с РНК). Все 10 структур лежат в папке “tRNA” из сопроводительных материалов.

Пояснительный рисунок:

Для всех 10 тРНК на полученных структурах можно выделить CCA свободный “хвост” на 3’-конце. Для 7 из десяти получилась характерная 4 или 5 - шпильковая структура с явно выделяемой антикодоновой шпилькой (для всех из них найденный антикодон соответствует аминокислоте, данной в описании тРНК) Ещё три дали неоднозначно трактуемые структуры.

Количество тРНК в геноме меньше, чем 61 (число кодирующих аминокислоты триплетов). Поэтому мы посмотрели для каких аминокислот тРНК меньше, чем “должно быть”. Результаты представлены в таблице 2:

Затем мы отобрали те аминокислоты, для которых в таблице2 стоят 1 и 2 во втором и третьем столбцах соответственно и по описанному выше алгоритму смоделировали для соответствующих тРНК структуру и нашли, какой именно кодон им соответствует. Результаты отражены на рисунке 8:

А в таблице 3 приведены частоты встречи каждого из двух кодонов для этих пяти аминокислот:

Обсуждение

1) Сравнительно небольшой размер (относительно других видов) генома S. melonis можно объяснить а) нерепрезентативностью выборки видов; б) упрощением, вызванным переходом к фитопаразитизму или симбиозу с растениями (как штамм ZJ26 [6], который и изучали в этом обзоре)

2) Наименьший GC-процент в геноме оказался у психрофила, что логично: температура плавления ДНК повышается с ростом GC-содержания.

3) Код, применённый для нахождения шпилек, дал результаты, впоследствии подтверждённые построением вторичной структуры (рис.3 и рис.4), однако для доказательства его эффективности требуется проанализировать уж точно более 4 произвольно отобранных шпилек.

4) Построение вторичной структуры тРНК позволяет с высокой точностью назвать антикодон и соответствующую аминокислоту (в случаях, когда полученная структура однозначно трактуемая)

5) Неоднозначная трактовка вторичной структуры тРНК может быть результатом: того, что в наших последовательностях мы не учитывали возможность посттранскрипционной модификации некоторых нуклеотидов

6) Найденные нами шпильки могут выполнять регуляторную функцию, так так находятся рядом с началами и концами открытых рамок считывания

7) Неполный набор тРНК может быть важным регуляторным механизмом трансляции: те кодоны, у которых нет соответствующей тРНК, должны связываться с частично комплементарными тРНК, при этом скорость и вообще возможность трансляции, а также состав белкового продукта может меняться.

Сопроводительные материалы

Все сопроводительный матеориалы, упомянутые в тексте, можно найти в папке по ссылке: Сопроводительные материалы

Благодарности

Мы благодарим преподавателей кафедры информатики ФББ МГУ, проводивших занятия курса, в рамках которого выполнена эта работа.

Список литературы

1) Buonaurio R. et al. Sphingomonas melonis sp. nov., a novel pathogen that causes brown spots on yellow Spanish melon fruits //International journal of systematic and evolutionary microbiology. – 2002. – Т. 52. – №. 6. – С. 2081-2087.

2) Erguven G. O., Demirci U. Statistical evaluation of the bioremediation performance of Ochrobactrum thiophenivorans and Sphingomonas melonis bacteria on Imidacloprid insecticide in artificial agricultural field //Journal of Environmental Health Science and Engineering. – 2020. – Т. 18. – №. 2. – С. 395.

3) Tatar S. et al. Can toxicities induced by insecticide methomyl be remediated via soil bacteria Ochrobactrum thiophenivorans and Sphingomonas melonis? //Current Microbiology. – 2020. – Т. 77. – С. 1301-1307.

4) Wang H. et al. Characterization of a novel nicotine degradation gene cluster ndp in Sphingomonas melonis TY and its evolutionary analysis //Frontiers in microbiology. – 2017. – Т. 8. – С. 337.

5) Margesin R, Zhang DC, Busse HJ. Sphingomonas alpina sp. nov., a psychrophilic bacterium isolated from alpine soil. Int J Syst Evol Microbiol. 2012;62(Pt 7):1558-1563.

6)Matsumoto, H., Fan, X., Wang, Y. et al. Bacterial seed endophyte shapes disease resistance in rice. Nat. Plants 7, 60–72 (2021).